Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
1. Предварительно инкубируют мембраны (1-5 мг/мл по белку) в подходящем
буфере (например, фосфатном или трис-HCl), содержащем, если необходимо,
до 10 мМ вещества-ловушки. Инкубацию проводят при подходящей температуре
(в интервале 4-37 °С) и в атмосфере азота. Желательно использовать для
этого стеклянный сосуд (закрытый пробкой).
2. В темноте добавляют реагент, растворенный в смешивающемся с водой
органическом растворителе (обычно этаноле), так чтобы конечная
концентрация растворителя была менее 1% (или на том уровне, который ие
влияет на ход модификации и на функциональную активность белка/мембраиы).
Концентрация реагента должна быть в интервале от 10 мкМ до 1 мМ. С учетом
коэффициента распределения реагента его концентрация в мембране будет по
меньшей мере в 1000 раз выше, поэтому лучше брать реагент в низкой
концентрации. Проводят инкубацию с реагентом в течение 10- 30 мин.
3. Быстро замораживают образец в виде тонкой пленки путем введения его по
каплям в стеклянный сосуд, охлаждаемый жидким азотом. Эта операция ие
обязательна; она имеет смысл, когда диффузия активных промежуточных
продуктов к поверхности мембраны представляет реальную проблему.
4. Облучают образец в растворе или в замороженном состоянии в течение 1-
90 мин в атмосфере азота. Время облучения выбирают так, чтобы получить
требуемый уровень включения метки, но, с другой стороны, избежать
повреждающего действия облучения на биологические структуры. (Помните,
что стекло поглощает УФ-свет.) Можно использовать УФ-лампу, излучающую в
достаточно широком диапазоне длин волн, но лучше подобрать такой
источник, который испускает свет с длиной волны, отвечающей максимуму
поглощения реагента. Работать необходимо в защитных очках, поглощающих
УФ-свет; время экспозиции должно быть по возможности минимально,
облучение следует проводить в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемой
комнате. Продолжают инкубацию в темноте еще до 90 мии, чтобы н реакцию
вступили все долгоживущие активные частицы. Это особенно важно, если
модификация проводится при низкой температуре.
5. Тщательно промывают мембраны (после быстрого оттаивания, если оно
необходимо) в буфере, содержащем до 1 мг/мл БСА. чтобы удалить
нековалентно связанные продукты фотолиза. По другой схеме мембраны можно
сразу же растворить в ДСН или в системе FACE [120, 121) и осадить белки
7-10 объемами холодного ацетона.
6. Важно включить в методику два контрольных опыта.
а. Образец мембран инкубируют с реагентом, но не облучают, и затем
проводят все операции в темноте.
б. Образец мембран инкубируют в темноте с предварительно облученным
реагентом (скажем, при его концентрации до 10 мМ) и затем проводят все
операции в темноте.
Первый контрольный опыт позволяет учесть те взаимодействия, которые не
обусловлены активными частицами. Второй дает возможность оценить степень
модификации за счет образования долгоживущих частиц, причем в зависимости
от того, как скоро после облучения реагент был добавлен к мембране, можно
провести оценку времени жизни активных частиц.
таких реагентов как своеобразных мембранных "глубиномеров" является
проблематичным. Фотоактивируемые аналоги фосфолипидов обычно включают в
реконструируемые мембраны вместе с природными фосфолипидами в мольных
отношениях от 1 : 10 до 1 : 1000. Ключевым моментом при этом является
пра-
Выделение и модификация мембранных белков
291
вильная ориентация белка в реконструированной мембране, соответствующей
его нативной организации in situ (гл. 5). Особый интерес представляют
амфифильные реагенты на основе модифицированных жирных кислот, которые
могут включаться в мембрану в ходе биосинтеза in vivo [137].
6.4. Сшивающие реагенты
Один из наиболее распространенных подходов к выяснению молекулярной
организации белков основан на использовании бифункциональных реагентов,
которые могут ковалентно соединять друг с другом компоненты, находящиеся
в достаточно длительном контакте за время эксперимента (общий обзор см. в
[117, 138]). За последние годы число имеющихся реагентов такого типа
существенно возросло, и сейчас имеется широкий выбор реагентов,
различающихся по размеру, реакционной способности и природе активных
группировок. Наиболее распространены реагенты трех видов: имидаты, N-
гидроксисукцин-
имидные эфиры и их водорастворимые сульфонатные аналоги и
фотоактивируемые арилазиды. Соединения, относящиеся к первым двум
группам, реагируют почти исключительно с аминогруппами, тогда как
модификаторы третьей группы имеют более широкую направленность и
реагируют с любыми нуклеофилами. Некоторое применение нашли также
активированные галогенсодержащие реагенты (например, иод- и бромацетиль-
ные производные) и малеимиды, особенно в тех случаях, когда речь шла о
модификации тиольных групп. В табл. 6.7 перечислены различные
модифицирующие реагенты и указана их специфичность. Бифункциональные
группировки могут представлять собой комбинацию как двух одинаковых
