Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
6.5 приведен длинный, но все же неполный список соответствующих
реагентов; перечислены главным образом те вещества, которые
использовались для изучения мембран и легко доступны или могут быть
получены несложным химическим синтезом. Характерным примером того, как
такие реагенты (и протеазы) можно использовать для характеристики
топографии мембранных белков, является исследование родопсина (см. обзор
[85]). В Приложении IV содержится список перспективных реагентов, которые
могли бы использоваться для изучения мембран, но пока не нашли применения
в таких исследованиях.
6.1. Реагенты, модифицирующие поверхностные белки
Во многих мембранных исследованиях очень важно предотвратить
проникновение или транспорт модифицирующего реагента через мембрану.
Реагент считается проникающим, если доказано или есть основания полагать,
что он способен внедряться в мембранный бислой или проходить через него.
Однако во многих случаях изучаемые биологические системы обладают
свойствами, предотвращающими такое проникновение. Кроме того (например,
при использовании ангидридов), реакционная способность модифицирующего
реагента может быть настолько велика, что он будет либо быстро
инактивироваться в воде, либо вступать в реакцию с функциональными
группами фосфолипидных молекул. Проводя модификацию при низких
температурах (0-4°С), можно ингибировать транспортные системы или снизить
их активность. В конечном счете многие модифицирующие реагенты можно
считать практически непроникающими через мембрану. Тем не менее, чтобы не
было сомнений в достоверности полученных данных, в конце модификации
перед проведением остальных операций рекомендуется инактивировать
модифицирующий реагент и удалить как можно большую его часть промыванием.
Поскольку нековалентное связывание с поверхностью мембраны может
оказаться довольно прочным, часто бывает полезно включить в отмывающий
буфер белок, который способен связывать реагент (например, БСА в
концентрации 1 мг/мл).
6.1.1. Иодирование
Использование I2SI в качестве радиоактивной метки оказалось особенно
успешным благодаря легкости ее детектирования (^-излучение), высокой
удельной радиоактивности и довольно большому периоду полураспада (60
сут). ,2SI можно вводить
Выделение и модификация мембранных белков
281
в белок прямым иодированием тирозиновых остатков или путем присоединения
остатков, содержащих иод в качестве заместителя, к боковым цепям ряда
аминокислот. Самой мягкой является методика иодирования с использованием
фермента лак-топероксидазы.
I. Лактопероксидаза [109, 110]. Этот фермент катализирует включение
иодид-ионов в .мега-положение бензольного кольца тирозинового остатка в
ходе реакции, зависящей от перекиси водорода. В присутствии Н202 в
высокой концентрации быстро образуется молекулярный иод и происходит
ингибирование фермента. Поскольку 12 способен иодировать как липиды, так
и белки и легко проникает через бислой, вопрос о том, находится ли
присоединившаяся метка только на поверхности мембраны, остается неясным.
Эта неопределенность в значительной мере снимается при включении в
реакционную смесь глюкозо-оксидазы, которая продуцирует Н202 из глюкозы
примерно с такой же скоростью, с какой она потребляется лактоперокси-
дазой (т. е. за все время реакции Н202 не будет присутствовать в
избытке). Полагают, что иммобилизация лактопероксидазы на каком-либо
нерастворимом носителе дает возможность проводить модификацию только на
поверхности мембраны. В простейшем варианте используют гранулы, на
которых одновременно иммобилизованы как лактопероксидаза, так и глюкозо-
оксидаза (Enzymobeads - Biorad). 12 может образовываться также из I" под
действием пероксидаз, содержащихся в белках. Поэтому часто бывает
необходимо ставить контрольный опыт без добавления лактопероксидазы.
Методика
1. Смешивают компоненты так, чтобы их конечная концентрация составляла:
200 мМ фосфатный буфер с pH 7,2 (или за-буференный фосфатом
физиологический раствор, буфер PBS), мембранная (клеточная) суспензия -
не более 1 мг белка на 1 мл, 20 мМ p-D-глюкоза, 1 мКи Na[125I] без
носителя. Присутствие азидов и тиолов должно быть исключено, поскольку
они ингибируют иодирование.
2. На каждые 100 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл препарата
Enzymobeads или 2 мкг лактопероксидазы в смеси с 1 ед. глюкозооксидазы.
3. Инкубируют 10-30 мин при 4-25 °С.
4. Промывают мембраны (клетки) три раза фосфатным буфером.
5. Осаждают гранулы центрифугированием (100g, 10 мин). Перед
центрифугированием мембраны можно растворить в детергенте.
6. О степени неспецифической модификации можно судить, измеряя содержание
1251 в экстрагированных липидах (гл. 3).
Таблица 6.4. Реагенты для химической модификации мембран
Аминокис- лота Проникающие реагенты Непроиикающие реагенты
Реакции/условия/пояснения Ссылки
Цпстеин Уксусный ангидрид Бром-, хлор- и иодуксус-ная
кислота/ацетамид См. другие ангидриды, упомянутые в случае лизина.
