Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Не совсем ясно, почему некоторые клетки являются пермис-сивными для данного вируса, а другие — нет. Вероятно, непермис-сивная клетка утрачивает определенные факторы, необходимые для вирусной репликации. Непермиссивные клетки, трансформированные ДНК-содержащими вирусами и обладающие полным вирусным геномом в качестве провируса, экспрессируют только часть вирусных генов, а именно ранние гены. Репликация вирусной ДНК не наблюдалась, а поздние вирусные гены не транскрибировались и не транслировались. Пермиссивные клетки обладают факторами, способствующими сдвигу вирусного репликативного цикла от ранних генов к поздним. Учитывая эти различия, становится понятным, что пермис-
190
сивные, полупермиссивные и непермиссивные клетки неодинаково отвечают на вирус.
Другой важный момент в отношении клеточных культур заключается в том, что многие исследования по трансформации клеток опухолеродными вирусами проводились на клеточных линиях грызунов, таких, как ЗТЗ и ВНК-21, или различных клонах этих линий. Клет-ки, поддерживавшиеся in vitro в течение длительного времени и в разных условиях, имеют сомнительную ценность нормальных клеток (Boone, 1975; Boone et aL, 1979). Действительно, исследования в нашей и многих других лабораториях показали, что клетки ВНК-21/С113 являются туморогенными для хомячков. Использование таких клеточных линий для трансформации ДНК-содержащими опухолеродными вирусами, которая в популяции встречается с относительно низкой частотой, поднимает несколько вопросов, связанных с селекцией субпопуляции и процессами трансформации. Казалось бы, что первичные клеточные культуры более подходят для изучения клеточной трансформации. Однако даже при использовании этих культур многие факторы, вероятно, определяющие их ответ, часто не рассматривались. Они включают следующие: виды, из которых выделены клетки; возраст животного; используемый метод для инициации культуры, однородность культуры; орган(ы), или тканевое происхождение; продолжительность культивирования; присутствие вирусов-пассажиров или других контаминантов. Все эти факторы важны, особенно при работе с клетками грызунов, которые «спонтанно» трансформируются in vitro (см. Barrett, 1980, и ссылки там же).
Важно также для сравнения с трансформированными клетками выбрать соответствующие нормальные клетки. Например, множество агентов, таких, как диметилсульфоксид, колибрен, диэтиламинодек-стран и двухвалентные катионы, которые часто используются для изменения клеточной поверхности мембраны с целью увеличения попадания вируса или вирусных нуклеиновых кислот в реципиент-ные клетки. Хотя такие агенты известны своим действием не только на мембрану, но и другими свойствами, в частности транскрипцией генома, ложно инокулированные контроли, получавшие только эти агенты, редко использовались в последних исследованиях, сравнивающих вирустрансформированные и нормальные клетки. В интенсивных исследованиях клеточных линий почек африканских зеленых мартышек, трансформированных определенными участками генома вируса SV40 (Arizpe et al., 1981), показано, что ложно инокулированные клетки обнаруживали некоторые фенотипические различия по сравнению с необработанными родительскими клетками. Таким образом, должны планироваться эксперименты по сравнению свойств вирус-трансформированных, нормальных ложноинокул ированных и нормальных родительских клеток.
Некоторые субкультуры и условия их культивирования чрезвычайно важны, но многие исследования, особенно по молекулярной биологии интеграции вирусного генома и персистирования, часто проводят на культурах неизвестного уровня, в которых проис-
191
ходит много удвоений популяции после первоначального этапа трансформации, Клонируемые популяции, используемые для сравнительных исследований, могут быть выделены из этих клеток только на более поздних пассажах. Тем не менее для объяснения первоначальных событий вирус-индуцированной трансформации часто использовались данные, полученные при изучении этих клеток.
Последняя особенность, обнаруженная при изучении клеточных культур — возможная контаминация случайными агентами,; включая вирусы (переносчики персистирующих инфекций или провиру-оов), микоплазму, бактерии, грибки или другие микроорганизмы. Некоторые из многих типов экспериментов, которые сопровождались такими контаминациями, включают исследования ДНК- или РНК-полимераз, требований для клеточного фактора роста^ популяций и синтеза ДНК и РНК.
6.4.2. Условия культивирования
Условия поддержания клеточной культуры и число субкультур или удвоений популяции в определенный период времени часто не учитывались при экспериментальном планировании и представлении или сравнении данных с результатами, полученными другими исследователями.
Обычно принималось, что клеточные культуры поддерживались в виде монослоя или суспензий, варьирующих по их ростовым свойствам in vitro, и что клетки со способностью расти в суспензии как агрегаты могут обладать более высокой онкогенной потенцией. Для клеток, растущих монослоем или в суспензии* как и для клеток с их комбинированным ростом, можно подобрать условия культивирования. Методы и схемы субкультивирования и выбор среды, в которой клетки будут расти, крайне важны. Некоторые предназначены для роста клеток в суспензии. Культуральные среды, используемые для размножения клеток в монослое, высоко вариабельны, и специфический выбор особенной среды редко проводится исследователями. Например, обоснованно ли сравнивать свойства клеток, растущих в минимальной среде Игла, свободной от антибиотиков, но содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, с клетками, растущими в среде Ham (F-10), содержащей 5 % телячьей сыворотки, 1 % лошадиной сыворотки, 10 % триптозофосфатного бульона, 1 % экстракта куриных эмбрионов и антибиотики.
