Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, классификация методов ИФА может быть
\
/
представлена схемой 4.2, из которой следует большее многообразие анализов типа II и отсутствие конкурентных и гомогенно-гетерогенных методов типа I.
• На сегодняшний день разработано более тридцати вариантов различных методов ИФА, различающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных стадий. Такое множество вариантов анализа обусловлено в основном различными способами модуляции ферментативной активности в гомогенных методах и использованием различных комбинаций меченных ферментами и иммобилизованных на носителе реагентов (антигенов и антител) в гетерогенном ИФА.
Однако все эти методы могут быть классифицированы согласно приведенной выше системе. Более детальную классификацию известных методов гетерогенного и гомогенного анализов можно осуществить с учетом схемы 4.2 и типа используемых в анализе меченных ферментами реагентов — антигентов, антител и вторичных антител.
В связи с различиями в последовательности проведения отдельных стадий анализа целесообразно раздельно рассматривать методы определения антигенов и антител в гетерогенном и гомогенном ИФА.
§ 2. Классификация гетерогенных методов ИФА
Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов—антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохи-мических комплексов от несвязавщихся компонентов. Поэтому принцип разделения гетерогенных методов может быть представлен схемой 4.3.
В соответствии с таким делением в табл. 4.1 указаны варианты гетерогенных методов ИФА антигенов, основанные на определении специфических иммунных комплексов (т. е. относящихся к (типу I), в табл. 4.2 — варианты гетерогенных методов ИФА антител типа I, в табл. 4.3 — гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического свя-
Таблица 4.1. Гетерогенные методы ИФ\ антигенов,
основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I)
Меченый реагент Иммобилизованный реагент Неконкурентные Конкурентные
твердо гомоген твердо гомогеи*
фазные но-гете фазные но-гете-
рогенные ро генные
Антитела Специфическое Антиген ||---Q
Антитело U---^ Есть
Антивидовое антитело |j---^ Есть
Антивидовое Антиген ^---Q
Антитело Есть
Антивидовое антитело
Антигеи' О”© Антигеи Ц---¦?)
Антитело Ц---^
Антивидовое антитело ||---^
зывания (т. е. относящихся к типу II), и в табл. 4.4 — гетерогенные методы ЙФА антител типа II. Для наглядности таблицы имеют одинаковые графы, соответствующие максимальному количеству схем ИФА, хотя количество схем для данного типа анализа, естественно, меньше. Схемы, представленные в этих таблицах, достаточно полно отражают Известные в настоящее время методы ИФА, но не затрагивают деталей, как, например, использование не целых антител, а только их Fab-фрагментов, типа носителя, способа получения иммуносорбента и т. д. Остановимся на более подробной характеристике каждого метода в порядке расположения в табл. 4.1—4.4.
Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I). К этой группе могут быть отнесены только три метода (см. табл. 4.1), причем все они являются неконкурентными.
Методы с использованием меченых антител и иммобилизованных антител. Один из наиболее распространенных на практике методов основан на применении меченных ферментом специфических антител и иммобилизованных антител. Схема метода:
4) отмывка
Условные обозначения, используемые на этой и последующих схемах:
К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется специфический комплекс антиген—антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich). Часто,в литературе встречается и другое его название — двухцеитровой метод ИФА (англ. two—site assay). Как следует из описания метода, он может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по кр!айней
