Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
д. Образец разведите до 50 мкл и нанесите на биогель.
е. Центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 об/мин.
ж. Добавьте 50 мКл буфера для промывки и центрифугируйте. :
з. В нижней пробирке собирается около 100 мкл ДНК, меченной 32Р.
5. При центрифугировании на высокой скорости через отверстие в дне
пробирки могут пройти зерна Р60. Чистоту центрифуги от радиоактивности
проверьте с помощью ручного счетчика.
VI. Общие замечания
Выше описывалось, как проводить реакцию в объеме 25 мкл. Можно успешно
проводить реакцию и в объемах менее 10 мкл.
Большинство коммерческих препаратов ДНК-полимеразы I Е. coli содержит
существенные примеси ДНКазы, так что добавление ДНКазы (разд. III данной
методики) может оказаться ненужным.
Литература
Rigby P. W. J., Dieckmann М., Rhodes С., Berg Р., 1977. Labeling
deoxyribonucleic acid to higb specific activity in vitro by nick
translation with DNA polymerase I, J. Mol. Biol., 113, 237.
23. Гибридизация с иммобилизированной ДНК или РНК
125
Какой сюрприз! Участник фаговых курсов 1951 г. Вацлав Шибальский явно
испугался, когда обнаружил, что колония сильно слизистого устойчивого к
хлорамфениколу мутанта Е. coli выросла от поверхности агара до самой
крышки чашки Петри [Microbial Genetics Bull., № 5, 10 (1951)]. Этому спо-
, собствовала только что разработанная методика градиентных чашек
[Science, 116, 46-48 (1952)].
Методика 23
Гибридизация с иммобилизованной ДНК или РНК на твердом носителе
1. В полипропиленовую пробирку внесите зонд (меченный 32Р или 1251 с
помощью ник-транслядии), растворенный в буфере ТЕ [10 мМ трис (pH 7,5), 1
мМ Ыаз-ЭДТА). Используйте зонд в количестве, соответствующем примерно
106-5-10(r) расп./мин.
126
Раздел II. Методики
2. а. Чтобы денатурировать ДНК, прогрейте в течение 10 мин
при 95°С.
или
б. Добавьте 7ю объема 1 М NaOH. Через 10 мин добавьте 7ю объема 1,8 М
трис-HCl и 0,2 М трис-основание.
3. Поместите фильтры с иммобилизованной ДНК или РНК в пластиковый
мешочек, который можно заварить.
4. а. Добавьте примерно 4 мл раствора, содержащего буфер
SSPE 5Х+0,3% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной и разрушенной ультразвуком
ДНК-носителя (из спермы лосося) и 50% (об/об) формамида (МСВ), в расчете
на 100 см2 фильтра.
или
б. Проведите предварительную обработку фильтра. Поместите его в
мешочек, который можно заварить, и в расчете на фильтр площадью 100 см2
добавьте 4 мл раствора, содержащего 50% (об/об) формамида (МСВ), SSPE 5х,
BFP 5Х [BFPlX=0,02% (в/об) бычьего сывороточного альбумина, фиколла (мол.
вес 400 000) и поливинил-пирролидона], 1% глицина и 100 мкг/мл
денатурированной и обработанной ультразвуком ДНК-носителя (из спермы
лосося). Инкубируйте при 42°С не менее 1 ч. Удалите раствор,
использованный при такой предварительной обработке. Для фильтра площадью
100 см2 приготовьте 4 мл раствора, содержащего 50% (об/об) формамида,
SSPE 5Х, BFP IX, 100 мкг/мл денатурированной и обработанной ультразвуком
ДНК-носителя (из спермы лосося), 10% (в/об) натриевой соли
декстрансульфата 500 [можно приготовить исходный раствор 50% (в/об)] и
0,3% ДСН. Половину этого раствора добавьте в мешочек с фильтром и
перемешайте. К оставшейся половине добавьте денатурированный зонд, хорошо
перемешайте и все это добавьте в мешочек. Натриевую соль декстрансульфата
можно не добавлять.
или
в. На фильтр площадью 100 см2 добавьте около 4 мл раствора,
содержащего SSPE5x+0,3% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной и обработанной
ультразвуком ДНК-носителя (из спермы лосося).
5. Добавьте денатурированную ДНК-зонд в количестве ~ 10(r) расп./мин.
Следите, чтобы 32Р не попал на тот участок мешочка, где его будете
заваривать. Заварите мешочек.
6. Герметизированный мешочек (мешочки) поместите в другой мешочек и тоже
заварите его. Чтобы не допустить высыха-
23. Гибридизация с иммобилизованной ДНК или РНК
127
ния фильтра, в наружный мешочек положите влажное бумажное полотенце.
7. а-б. Если гибридизацию проводите в 50%-ном растворе
формамида, то ведите ее в течение 3-48 ч при 42°С.
или
в. Если гибридизацию проводите в водной среде, то ведите ее при 65°С в
течение 3-24 ч.
8. Удалите из мешочка радиоактивную гибридизационную смесь. Ее можно
использовать для повторных гибридизаций (см. обсуждение).
9. Разрежьте мешочек и выньте фильтр.
10. а. Промойте три-четыре раза, инкубируя с покачиванием
при 45°С по 5-15 мин в 250 мл раствора SSPE 2х + 0,2% ДСН.
или
б. Промойте три-четыре раза, инкубируя при 37°С по 5- 15 мин в 250 мл
раствора 20 мМ Nai,5Hi 5РО4 + 0,2% ДСН и 1 мМ Ыаз-ЭДТА.
или
в. Промойте три-четыре раза, инкубируя по 5-15 мин при комнатной
температуре в 250 мл 10 мМ< Nai,5Hi>5P04 + + 0,2% ДСН и 1 мМ Ыаз-ЭДТА.
11. Высушите фильтр, заверните его в пластик и экспонируйте с
рентгеновской пленкой. Для того чтобы маркировать и ориентировать фильтр,
можно завернуть вместе с ним в пластик кусочек бумаги, надписанный
радиоактивными чернилами. (См. методику 24.)
BFP 100Х=2% (в/об) бычьего сывороточного альбумина, фи-колла и
