Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
бляшки на чашке сливаются, то пятен гибридизации видно не будет.
Поскольку размер бляшек обратно пропорционален количеству высеваемых для
газона клеток, то при необходимости можно сделать бляшки нужной величины.
Использование подсушенных чашек снижает вероятность захвата частиц
верхнего агара на этапе 6.
2. Повышение твердости агара при охлаждении предотвращает захват частиц
верхнего агара на этапе 6.
3. Можно пользоваться нестерильными фильтрами прямо из упаковки. Если под
фильтром окажутся пузырьки воздуха, то они будут препятствовать переносу
ДНК на фильтр. В этом месте ошибочно будет получен отрицательный
результат.
4. Адсорбция происходит почти мгновенно. Поэтому после того, как фильтр
коснулся чашки, не сдвигайте его.
5. Это одна из наиболее сложных операций. Рекомендуем пользоваться вторым
методом (5, б). При расщеплении Xgal р-галактозидазой образуется
соединение голубого цвета. Фаг, который несет область lac, образует в
присутствии Xgal голубые бляшки. Такие бляшки остаются голубыми в течение
по крайней мере нескольких дней. Так как Xgal не является индуктором, то
большинство клеток газона окраски не дает. Фаг с областью lac индуцирует
синтез р-галактозидазы потому, что репрессор этого оперона титруется
большим числом копий оператора.
6. Будьте осторожны, чтобы не захватить верхний слой агара. Если это
произойдет, то смойте агар на этапе 7.
7. (Этапы 7-10); это обычные процедуры, выполняемые при работе с
нитроцеллюлозой. Точное выполнение этих операций не является критическим.
Даже при опускании этапов 7-9 слабые сигналы гибридизации все еще будут
наблюдаться. Не проводите отжига фильтров в течение более 2 ч и не
нагревайте их выше 80°С. В противном случае фильтры станут еще более
ломкими, чем обычно.
8. (Этапы 11 и 12); как правило, трудно сопоставить пятна почернения на
пленке с определенными бляшками на чашке. Обычно из той области чашки, в
которой произошла гибридизация, мы зубочисткой или платиновой проволочкой
перекалываем несколько бляшек на газон чувствительных клеток. Если пять
раз уколоть примерно в одно и то же место, то образуется большая бляшка.
Перекалывайте бляшки по шаб-
120
Раздел II. Методики
лону. С чашки с переколотыми по шаблону бляшками снимите фильтр-реплику.
После того как выявите бляшки нужных фагов, проведите их очистку и
повторную проверку.
Литература
Benton W. D., Davis R. W., 1977. Screening of 7.gt recombinant clones by
hybridization to single plaques in situ,, Science, 196, 180.
III. Перенос из бактериальных колоний
1. Вырастите колонии, посеянные по шаблону на селективную чашку.
2. Получите отпечаток на сухой нитроцеллюлозный фильтр (диаметром 82 мм;
Schleicher and Schuell ВА85 или HAWP Millipore) или на смоченную
(бульоном) бумагу ватман 540. Пользуйтесь каким-либо из следующих
способов:
а. Положите фильтр прямо на колонии, пока они еще достаточно малы. После
этого перенесите фильтр на свежую селективную чашку, поместив его таким
образом, чтобы сторона с колониями была обращена не к среде, а к воздуху.
Таким образом можно сделать только один отпечаток.
б. С помощью бархата перепечатайте колонии на фильтр, положенный на новую
селективную чашку. Таким способом можно сделать несколько отпечатков.
в. Вырастите колонии в ячейках планшета для микротитрования. С помощью
штампа перенесите их на фильтр. Таким способом можно получить мнрго
отпечатков, на которые нанесены одинаковые количества клеток.
3.- Когда на фильтре вырастут колонии, фильтр осторожно снимите. Пометьте
его ориентацию, пользуясь мягким карандашом или сделав на фильтре вырезы.
Чтобы потом ориентировать рентгеновскую пленку и чтобы проверить
способность гибридизоваться и эффективность мечения ДНК-зонда, нанесите
на фильтр каплю с 10 нг денатурированной неме-ченной ДНК-зонда. Каждый
фильтр должен быть маркирован по-своему и несимметрично.
4. Положите фильтр на два листа бумаги ЗММ (14X23 см), намоченных в 30 мл
0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl, на 3-10 мин. Фильтр нужно накладывать так, чтобы
та сторона, на которой находятся колонии, была обращена вверх.
.5. Чтобы удалить избыток жидкости, перенесите фильтр на лист сухой
бумаги ЗММ. Фильтр кладите так, чтобы сторона с колониями находилась
сверху.
6. На 3-10 мин положите фильтр на два листа бумаги ЗММ
22. Внесение метки а-39-Р в ДНК с помощью ник-трансляции
121
(14X23 см), намоченных 30 мл 0,5 М трис (pH 7,5) и
1,5 М NaCl. Фильтр накладывайте так, чтобы сторона с колониями была
обращена вверх.
7. Поместите фильтр (стороной с колониями вверх) на аппарат для
отсасывания (воронку), включите насос. Дважды сполосните 25 мл 90%-ного
этанола, отсасывайте досуха.
8. Промокните между листами фильтровальной бумаги. Отожгите с прижатой
фильтровальной бумагой при 80°С в вакууме в течение 1,5-2 ч.
9. Гибридизацию проводите, как указано в методике 23.
10. Проявленную рентгеновскую пленку совместите с завернутым в пластик
фильтром. Пометьте на пленке ориентацию и маркировку фильтра.
