Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Отклонение, наблюдаемое для n-нитрофенилового эфира ацетилтриптофана, обусловлено общей для этого соединения и соответствующего метилового эфира лимитирующей стадией деацилирования ацилхимотрипсина. Для этой стадии ферментативного гидролиза расщепление n-нитрофениловых эфиров не является адекватной модельной реакцией.
Эффективность (3-лактамазы находится в интервале эффективности других протеаз, хотя модельные р-лактамы гидролизуются в неферментативных условиях примерно в 100 раз быстрее, чем обнчние амиды.
Сравнение эффективности различных амидгидролаз имеет, однако, относительную ценность, поскольку нет уверенности в том, что рассматриваемые сейчас субстраты являются наилучшими, а конгруэнтные модели действительно конгруэнтны. Важно отметить лишь, что амидгидролазы относятся к числу весьма эффективных ферменюв, причем не исключено, что их эффективность определяется стадиями ассоциации и диссоциации соответствующих комплексов с субст-
13. В.К. Антонов
ратами или продуктами. Для сравнения отметим, что, например, каталаза, обычно .рассматриваемая как пример одного из самых эффективных ферментов [20503), лишь в 5-103 эффективнее модельного катали-гематина [20513.
(й VK-= 4.107 M_V1
cat m
затора
На
значений й
Й /К
cat га
кривых распределения ^ "'cat'
большого числа ферментов [2041, с.703, данные для гидролаз укладываются вблизи максимумов (рис.69).
и й.
полученных для
хороших субстратов амид-
Рис.69. Плотности функции распределения [/(®)] констант скоростей лимитирующих стадий ферментативных реакций № t),
констант скоростей образования фермент-субстратных комплексов (Й ) и констант скоростей 2-гс порядка (й /К ) [2041 ]
Оценить относительную специфичность различных ферментов можно, сравнивая вероятности расщепления амидных связей в белках и пептидах [19563, т.е. отношение числа расщепляемых связей к общему числу связей в изученных последовательностях. Среди исследованных таким образом ферментов химотрипсин и пепсин относятся к наиболее специфинным:
Фермент Вероятность Фермент Вероятность
Химотрипсин 0,14 Эластаза 0,24
Пепсиь 0,15 Папаин 0,26
Термолизин 0,4 8
Однако к такт- оценкам следует подходить с осторожностью, поскольку они не учитывыют разную частоту встречаемости той или иной аминокислоты в последовательности белков.
Как уже отмечалось в разд.4.3.1.4, разные протеазы существенно отличаются по отношению к влиянию вторичных взаимодействий на катализ. Это относится не только к ферментам разных групп, но и к протеазам, входящим в одну и ту же группу, например химотрипсину и субтилизину BFN’ или эластазе. С этой точки зрения последние два фермента более специфичны, чем хиЖтрирсин, что противоречит приведенным выше данным [1956].
К сожалению, пока еще нет возможности сравнивать специфичность различных амидгидролаз безотносительно к выбранной серии субстратов, на основе критериев, изложенных в разд.4.3. Имяьтся большое число публикаций, в которых сравниваются сксрости гидролиза одного и того же или нескольких близких субстратов различными ферменташ, принедлежащил-д к родственным- типам (см., нацример: [419,772,1827,1833,1847,1848,1363,1Я68 (904,2052- 20593). Однако в целом оценка специфично :ти остается все еще довольно интуитивной.
4.6. Влияние модификации амидгидролаз на их активность
Модификация ферментов может приводить к существенным изменениям их эффективности и специфичности. Это часто позволяет составить представление о роли тех или иных участков молекулы фермента в проявлении им каталитических свойств. Можно различать три типа модификаций: 1) протеолитическая модификация, т.е. отщепление (или присоединение) определенного фрагмента полипеп-тидной цепи; 2) химическая модификация - введение в белок чужеродных фрагментов и группировок и 3) нап ),°влеьный мутагенез - замена одних остатков аминокислот на другие. Последний тип модификаций стал возможен в последнее время в связи с развитием техники рексмоингнтных молекул и, несомненно, имеет большое будущее в отношении исследований связи структуры и активности ферментов.
4.6.1. Протеолитическая модификация
Следует, во-первых, рассмотреть те модификации, которые встречаются в природе, т.е. зимогены, различные формы активных ферментов, возникающие за счет неоднозначной активации или действия постороших протеиназ.
Оказалось, что зимогены некоторые сериновых протеаз - химотрипсиноген и трипсиноген обладают заметной катали1 ической активностью 12060 2063] (табл.51).
Таблица 51. Активность зимогенов [2061 ] и соответствующих сериновых цротеаз
Белок BocClyONp* ZSerflyGlyCNp*
Й +, К .ю3, Й JK , fecat’ К .103, Й JK ,
cat m cat m о"1 m cat m
-1 М 1Г1о~1 Ы м-1
с М 0
Химотрипсиноген 0,0077 2,7 2,85 0,0037 7,1 0,52
