Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Замена группы NH на атом кислорода или ее метилирование также приводит к резкому снижению каталитических констант (табл. 46).
Замена ацетаминогруппы в метиловом эфире ацетил-1-фенилаланил-1-фенил-
ТаСлица 46. Кинетические параметры катализируемого химотрипсином гидролиза соединений С.Н_СН„СН-СООС„Н_
О О d | с. Ь
X
X к +, с“1 Й'.Ю3, И &г, о 1 V °“1 К -103, м Литера
cat m 3 турный
источник
н 0,15 0,69 0,67 0,2 3,0 [1965]
0С0СН3 0,6 23 [1988]
N(CH3)C0CH3* 0,023 7,5 0,026 0,25 8,4 [1989]
NHC0CH3 96,5 0,9 800 110 7,6 [1965]
’Производные тирозина.
аланина на ацетоксигруппу полностью лишает ^слученное соединение способности гидролизоваться в присутствии пепсина, однако значение константы ингибирования, пепсина этим веществом совпадает с Кт исходного субстрата [1990].
Следует отметить, что негативная роль ацетоксигруппы может быть "компен-сированг" вторичными взаимодействиями. Так, карбоксамидометиловый эфир аце-тилглицил -,т,-фенилмолочной кислоты
СН3С0ШСН2С00СНС00СН2С0Шг
1н2сбн5
гидролизуется химс грипеином с более высокой скоростью, чем метиловый эфир N-ацетилфенилаланина (ftcat=V6 с 1, ^т=0,5 мМ) [1991].
Ациламиногруппа вносит практически постоянный, не зависящий от тигга р.циламинокислоты вклад в ускорение реакции химотрипсином. На стадии деаци-лирования хорошо выполняется соотношение [1992]:
lgft3(NHC0CH3) <* lgft3(H) +2,4,
(51 )
т.е. константа скорости деацилирования увеличивается при переходе от не содержащих ациламиногрупп субстратов к содержащим эту группу примерно в 250 раэ.
Увеличение гидрофобности R1 в ациламиногруппе ¦ приводит к уменьшению величины Ке и й так, что соответствующие корреляционные уравнения имеют примерно одинаковый угловой коэффициент, но с разным знаком [1964, с.135]:
lgft2/Ks = (0,6±0,1)тс + const, lgfe2 = - (0,7±0,1 )7с + const.
(52)
(53)
В то же время константа скорости деацилирования (й3) практически не зависит от гидрофобности остатка R1 [1970].
Симбатное изменение й2 и Кд скорее всего свидетельствует об увеличении степени непродуктивного связывания при увеличении гидрофобности ациламино-группы (см. разд.4.1.4).
Интересные данные были получены [1992] при анализе температурной зависимости констант й для серии содержащих и не содержащих ациламиногруппу суб-
ЛН* таи/толь
Рис.60 Зависимость энтальпии активации реакции деацилирования ацилхимотрипсинов - производных N-ацетиламинокислот (а) и нормально’ алифатических карбоновых кислот (б) от энтропии активации [1992]
R=CH3 (;); С2Н5 (2); Н-(3); н-СбН13 (4);
Н (5)1 н-С4Нд (6); Н-С5Н1, (7); СН2С6Н5 (а);
СН2СбН40Н-гг (9); скорости реакции измерены
методами рН-статирования (J) и спектрофото-метрии (и)
стратов химотрипсина. Как видно из рис.60, реакцга гидролиза субстратов, содержащих одинаковую боковую цепь, но отличающихся наличием ациламиногруп-ш, протекает с практически одинаковой энтальпией активации и в то же время с сильно различающимися энтропиями активации. Таким образом, ациламиногруп-па вносит, по-видимому, энтропийный вклад в ускорение гидролиза специфических субстратов химотрипсина.
Заместители при а-С-атоме. Замена атома водорода при а-С-атоме производных ациламинокислот на более объемистые группировки приводит к полной потере субстратных свойств [1993,1994]. Однако относительно небольшие группы, введенные в a-положение, все же не препятствуют гидролизу [1995].
Уходящая группа и тип расщепляемой связи. Характер уходящей группы имеет решающее значение в реакционной способности производных карбоновых кислот по отношению к данному нуклеофилу. В ферментативном катализе роль основности уходящей группы может маскироваться ее взаимодеЗстЕлем с ферментом. Для большого числа неспецифических и так называемых полуспецифических субстратов (эфиров, анилидов и некоторых других производных ациламинокислот) зависимость скорости ферментативного катализа от рКа уходящей группы исследовалась весьма интенсивно, причем в случае катализа химотрипсшюм [1473,1534, 1996-гоог] и пепсином [2003-2005] были толучены противоречивые данные. По-видимому, линейная зависимость рК& уходящей группы и константы скорости ферментативного гидролиза № t) наблюдается лишь в относительно узком интервале значений рКа (рис.61). В целом же для химотрипсинового катализа такая зависимость отсутствует [2000,2001].
Влияние гидрофобности уходящей группы на катализ химотрипсином гидролиза алкилацетатов было исследовано в реакции переноса ацетильной группы на спирты в процессе гидролиза п-нитрофенилацетата [2006] Было показано, что скорость переноса коррелирует с гидрофобностью с угловым коэффициентом, близким к единице, лишь для ограниченного "тела спиртов (от этанола до бу-тиноль). Другие спирты подчиняются в этой реакции корреляционным зависимостям с другими угловыми коэффициентами (см. также: [2007]).
