Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
4.3.3. Стереоспецифичность
Подавляющее большинство амидгидролаз проявляет стереоспецифичность, т.е. катализирует гидролиз лишь одного энантиомера асимметрического субстрата L{S) или D(R):
СОХ... сох...
I I
I 1
с С
i XR r/INmh
Н н
L(S)~ форма С(Д)-форма
Очевидно, что стереоспецифичность будет проявляться в том случае, когда субстрат взаимодействует с ферментом по крайней мере тремя группами, окружающими асимметрический атом [2016]. Слово "взаимодействие" здесь не обязательно означает связывание, но может означать наличие пространственных за-
труднений для вхождения какой-либо группы в данный участок активного центра фермента.
Для протеаз можно различать первичною и вторичную стереоспецифичность в соответствии с влиянием на скорость гидролиза стереохимии аминокислотнсго остатка, образующего расщепляемую связь, и остатка, удаленного от этой связи.
Первичная стереоспецифичнооть большинства протеаз не проявляется в связывании субстрата. Так, значение К{ (Кт) комплексов а-химотрипоина с D-энантиомерами производных оциламинскислот даже несколько меньше, чем величины Кт для комплексов с I-эчантиочерами (табл.47) [2017,2018]. Не сказывается на связывании также изменение конфигурации у остатков, удаленных от расщепляемой связи в пептидной цепи.
Таблица 47. Кинетические параметры химотрипсинового гидролиза n-нитрофениловых эфиров бензилоксикарбониламинокислот [2017]
Субстрат ¦rc 63(b) ft ./К (I)
cat m'
ь3 m k ,/K (D)
cat m
ZAlaONp 0,5 2,41 33,8 14,1
ZButONp 1,0 0,9 76,8 83,8
ZNvlOMp 1,5 0,84 54,7 64,6
ZLeuONp 2,42 1 ,98 75,5 38,1
ZPheONp 2 ,?5 1 ,26 216 171
Изменение конфигурации а- С-атома у К-ациламинокислот влияет как на константу скорости деациллровани* соответствующих ацилхимотрипсинов, так и на константу скорости второго порядка №са1/Яп)• В зависимости от характера уходящей грувпы влияние стереохимии jy6cTpaTa может быть очень значительным (для амидов, метиловых эфиров) и относительно небольшим (для нитрофениловых эфиров) [2019].
Как видно из данных табл.47, увеличение гидрофобности боковой цепи субстрата .в целом приводит к увеличению отношения констант L- и С-изомеров. Однако- это отношение уменьшается при увеличении гидрофобности заместителя в Н-ациламиногруппе (рис.65). Таким образом, D-энантиомеры ведут себя в отношении зависимости от характера заместителя прямо противоположным по сравнению с 1-изомерами образом.
Очевидно, что эти соотношения являются следствием увеличения степени непродуктивного связывания при взаимодействии фермента с Д-энантиомерами по сравнению с Б-соединениями.
Рис.65. Зависимость констант скоростей ацили-рования в реакщадх химотршгеина с метиловыми эфирами и-ацилпроизводнчх Д-аланина от гидрофобности N-концевой группы субстрата [1970]
Ацильные группы: тетрагидрофурил (7), гиофекил (г), бензоил (з), о-анинобензоил(4), никотинил (51), ичочикотинил (б), ацетил (7)
1 Z я
Таблица 48. Обращенная стереоспецифичность химотрипсина к субстратам с ограниченной конформационной подвижностью (pH 7,8)
Если изменить строение субстрата так, что кон^-фмация его D-формы будет отвечать требованиям продуктивного связывания, то можно получить субстраты с обращенной стереоспецифичностью. Так, многие субстраты с ограниченной конформационной подвижностью обладают значительно большей реакционной способностью в D-форме, чем в L-форме (табл.48) [2020,2021].
Инверсия стереоспецифичности соединения (1) (табл.48) обусловлена, как оказалось [2021,2022,2026], тем, что в своей экваториальной форме [2027] оно конформационно совпадает с эфиром ТС-эцетил-L-фенилаланина (рис.66).
Рис.66. Возможное взаимное расположение D-3-кар-боетоксидигидроизокарбостлрила и ефир а N-ацетил-L-фенилаланина в активном центре а-химс рипсина [2029]
Аналогично ведет себя в отношении гидролиза этого соединения субтилизин [2028].
Результаты анализа конформации субстратов с ограниченной конформационной подвижностью, а также других типов "закрепленных” субстратов [1775], например
позволили составить представление о конформации типичных субстратов а-химо-трипсина в активном центре фермента [2029].
Влияние вторичной стереоспецифичности на кинетические параметры ферментативного гидролиза обычно слабее, чем влияние первичной стереоспецифичности, и зависит от степени удаления остатка с D-конфигурацией от расщепляемой связи (табл.49). Следует отметить, что стереоспецифичность протеаз практически исчезает, если реакцию проводить в неводных растворителях [2032].
Таблица 49. Влияние D-конфигурации аминокислотного остатка, удаленного от расщепляемой связи, на кинетические параметры гидролиза
Фермент Субстрат ft°at M~V~1 (ft УК )t Литера
cat ш L турный
[к УК )n источ
cat m V ник
