Люминесцентный анализ - Шлезингер М.А.
Скачать (прямая ссылка):
200 Б. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ В БИОЛОГИИ И ОРГ ХИМИИ [ГЛ. XII
нии и особенно при освещении интенсивность видимого свечения увеличивается, а цвет флуоресценции изменяется и становится сине-зеленым. В щелочном растворе повторяется та же картина, причем превращение вещества, флуоресцирующего сине-фиолетовым светом, в вещество с синезеленым свечением протекает много быстрее.
Чтобы проследить это превращение и выяснить флуоресцентным методом его причину, мы фотографировали спектры свечения фолликулина
на отдельных стадиях его превращения [13] и для каждого снятого спектра установили, при какой длине волны лежит максимум почернения на негативе спектра, а равным образом, как почернение спадает в сторону больших и меньших длин волн. Сопоставление кривых почернения, полученных фото-метрированием, показывает, что максимумы и в спиртовом 'и в щелочном растворах лежат для одного вещества около 420 ммк, для другого - около-465 ммк. О течении самого превращения дают представление три кривые, приведенные на рис. 54. Они показывают, чта
о г, v . распределение интенсивностей
*1 ис. 54. Микрофотограммы спектров флуо- ' 1 т
ресценции воднощелочных растворов фол- в спектре флуоресценции одного
ликулина. и того же щелочного раствора
' фолликулина постепенно изме-
няется при его засвечивании в течение различных периодов времени (максимально 6, 5 час). На кривой 1 присутствие второго вещества уже проявляется: при длине волны 465 ммк, отвечающей максимуму его флуоресценции, ясно виден "горб"; на кривой 2 мы обнаруживаем следы первого вещества по "горбику" при длине волны максимума первой кривой. Это обозначает, что первое вещество почти полностью превращено во второе. При дальнейшем освещении "горбик" становится еще меньше и, как видим, почти совершенно сглажен на кривой 3.
Эти наблюдения дают основание для предположения, что описанное превращение не связано с разрывом основного скелета гормона и обусловливается более поверхностным изменением молекулы в результате ее окисления.
Увеличение в молекуле числа сопряженных двойных связей ведет всегда, как указывалось выше (гл. IV), к перемещению спектров как абсорбции, так и флуоресценции к красному концу. В отношении самого фолликулина - соединения, не имеющего сопряженных связей иных, кроме как в бензольном ядре,-представляется мало вероятным, чтобы какой-либо из его изомеров мог флуоресцировать в растворе сине-зеленым светом. Наоборот, у эквиленина, производного нафталинового ядра, естественно ожидать именно такое свечение, так как флуоресценция самого нафталина по сравнению с бензолом значительно смещена в сторону длинных волн.
1J
БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ВЕЩЕСТВА
201
Структурные формулы:
СН,0
сн3о
/ч
^\/\/
Фолликулин
Эквиленин
Таким образом, представляется весьма вероятным, что изменение цвета флуоресценции фолликулина обусловливается его окислением в эквиленин. Последний обладает значительно пониженной, по сравнению с фолликулином, биологической активностью. Этому вполне соответствуют данные относительно активности щелочных растворов фолликулина, флуоресцирующих зеленоватым светом.
Таким образом, первый прием флуоресцентного анализа в применении к фолликулину может быть использован не только для количественных определений, но и как чрезвычайно тонкий метод для обнаружения изменений, претерпеваемых гормоном.
В [14] авторы описывают разработанный ими метод определения концентрации эстрогенных веществ, пригодный для проверки продажных препаратов: эстрона в масле, водных суспензий эстрона и таблеток эстра-диола. Концентрацию они определяют по интенсивности флуоресценции растворов эстрогенных веществ в серной кислоте. При стоянии интенсивность свечения некоторых эстрогенных веществ остается без изменения. Это позволяет учитывать влияние примесей [15].
В [16] приводятся данные для пятнадцати эстрогенных веществ, характеризующие их флуоресценцию, их абсорбцию в ультрафиолетовой области спектра и их коэффициенты распределения в системах 50%-ный водный, метиловый Спирт - четыреххлористый углерод. В применявшихся условиях наблюдения только эстрон, эстрадиол С17 а, эстрадиол С17 |5 и эстриол обладали яркой флуоресценцией.
Для количественного определения эстрогенных веществ использована реакция их конденсации с фталевым ангидридом в присутствии ZnCl2, играющего роль катализатора [17]. При решении практически важной задачи количественного определения содержания эстрогенных веществ в моче возникают трудности в связи с тем, что в ней содержатся как флуоресцирующие, так и тушащие примеси. Разработаны методы отделения от них эстрогенных веществ [18], 119], предложена реакция с использованием фосфорной кислоты [20], выяснены условия, при которых эта же реакция- появление люминесценции при взаимодействии с фосфорной кислотой- может быть с успехом применена для количественного определения кортикостероидов [21]. Разработан адсорбционный метод выделения флуоресцирующего гормона фолликулина [22]. Описана реакция на стероиды с использованием р-толуол-сульфоновой кислоты [23].
в) Антибиотики. Разработаны методы количественного определения террамицина [24], [25] и ауреомицина [25] по интенсивности их люминесценции в спиртовых растворах. Оба антибиотика извлекают бутиловым спиртом из их щелочных растворов. Свечение ауреомицина достигает максимальной интенсивности при рН = 7,5-8, а террамицина - при
