Методы анализа молока и молочных продуктов - Инихов Г.С.
Скачать (прямая ссылка):
Метод ВНИИМСа. Отвешивают 2,5 г протертого на терке сыра, переносят его в центрифужную пробирку емкостью около 50 мл, приливают 28 мл воды, перемешивают и оставляют при температуре 45° С на 2 ч. Пробирки центрифугируют (1000 об/мин) в течение 10 мин. Раствор осторожно сливают через фильтр в колбу на 50 мл. Осадок два раза промывают дистиллированной водой по 10 мл, каждый раз центрифугируя и сливая жидкость через тот же фильтр в ту же колбу. Затем в колбу доливают воду до метки.
После перемешивания жидкости из нее берут 10 мл в другую колбу, прибавляют 30 мл 96% -ного этилового спирта, 2—4 капли 1 н. раствора уксусной кислоты и оставляют в холодильнике на 10—12 ч. Жидкость центрифугируют, сливая ее через фильтр в мерную колбу на 50 мл. Осадок промывают 80%-ным спиртом, собирая его в ту же колбу. Объем жидкости в колбе доводят спиртом до метки, перемешивают. Точной пипеткой отбирают 0,1 0,5 мл полученного раствора, переносят его на хроматографическую бумагу размером 6X6 см, высушивают ее в токе теплого воздуха.
Высушенную бумагу проводят через растворитель, состоящий из n-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:4. Бумагу просушивают 1 ч на воздухе, обрызгивают ее 0,5%-ным раствором нин-гидрина (реактив 109), слегка подсушивают и помещают на 15 мин в сушильный шкаф с температурой 90° С. После этого бумагу смачивают раствором азотнокислой меди (реактив 117) и выдерживают 20 мин в темном месте для закрепления окраски, во время которого бумажка подсыхает.
Бумагу разрезают на тонкие полоски, переносят в пробирку с пробкой, заливают 10 мл 80% -ного спирта и оставляют на 1 ч, несколько раз перемешивая массу. Окрашенный раствор колориметрируют в кювете емко-
188
стью 10 мм в колориметре ФЭК.-Н-57 (или ФЭК-М) при длине волны 500 нм с зеленым светофильтром. Количество азота свободных аминокислот в 100 г сыра вычисляют по формуле
где К — постоянный коэффициент для сыра (/(=11,8); e — оптическая плотность; g — масса 100 мл колоримет-рируемого раствора.
Сравнение показателя оптической плотности ведут с 80%-ным спиртом.
В растворах с небольшим количеством свободных аминокислот или других веществ, подлежащих разделению, используют круговую хроматографию, так как в противном случае осаждающиеся на бумаге вещества наслаиваются и затрудняют разделение. Метод пригоден для исследования очень молодого сыра, для сливочного масла. Резкость разделения лучше, чем при других методах бумажной хроматографии.
Определение аминокислот в сливочном масле
Подготовка к исследованию. В качестве хроматогра-фической камеры применяют большой эксикатор с краном на крышке или без крана (рис. 72). На дно эксика-
Рис. 72. Схема камеры для круговой хроматографии.
тора наливают воду, чтобы воздух в эксикаторе был насыщен водяными парами во избежание высыхания хро-матограммы. Уровень воды в эксикаторе не должен доходить до растворителя, который наливают в стаканчик и ставят на подставке на дно эксикатора. Можно вместо эксикатора использовать две большие чашки Петри. Камеру готовят заранее с тем, чтобы растворитель насытился водяными парами.
(89
На хроматографическую бумагу, вырезанную таким образом, чтобы она доходила до внешнего края крышки эксикатора, наносят графитным карандашом (циркулем) круги: стартовый круг от центра радиусом 1 см, на который наносят исследуемый раствор; г2 — граница собственно хроматограммы (n + 1 см); г3 — внешняя граница хроматографического круга; г4 — наибольший радиус-крышки эксикатора. С помощью транспортира или шаблона хроматограмму делят на восемь секторов (или на меньшее число), проводят соответствующие диаметры так, чтобы один из них совпал с направлением ориентации волокон бумаги.
В каждом секторе на стартовом круге ставят точку. В эти точки далее наносят исследуемые растворы. Заготовку хроматограммы вырезают из листа бумаги и в центре делают отверстие (язык). В образовавшееся отверстие вставляют цилиндрический фитиль, который изготовляют из полоски бумаги шириной 1—1,5 см. Ее навертывают спиралью на тонкую палочку, спираль удаляют и фитиль обкатывают пальцами в плотный стержень. Фитиль должен быть достаточно длинный, чтобы опускаться в стаканчик с растворителем, который ставится в эксикаторе на его подставку, но не длиннее 8 см.
Для пропитки буфером хроматограмму вынимают из фитиля, помещают в кювету с 1/15 M раствором фосфат-но-цитратного буфера (реактив 148), затем вынимают и просушивают при температуре 18—20° С в подвешенном состоянии.
В качестве растворителя используют смесь бутилового спирта, концентрированной уксусной кислоты и 1/15 M фосфатно-цитратный буфер (pH 4) в объемных соотношениях 4:1:5.
Приготовление водных вытяжек из образцов продукта. Продукт измельчают в ступке или на доске. Примерно 5 г продукта переносят в предварительно взвешенный стаканчик и взвешивают с точностью до 0,01 г. В этот же стаканчик приливают из мерного цилиндра горячую воду в соотношении вода : продукт 3,5: 1 (если вода вся впитывается продуктом, то отношение следует увеличить до 4 : 1 или до 4.5: 1). Через 30 мин водную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр в чистую посуду.
