Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
?-Фруктофуранозидаза (инвертаза) (?- Фруктофуранозид-фруктогидролаза. КФ 3.2.1.26)
?-Фруктофуранозидазу обнаруживают во всех почвах, она является одним из важных ферментов, характеризующих биологическую активность почвы.
?-Фруктофуранозидаза (сахараза, инвертаза) действует на глико-зильные соединения: гидролизует сахарозу, рафинозу, генцианозу и стахиозу; катализирует фруктотрансферазные реакции. При расщеплении сахарозы на глюкозу и фруктозу разрывается связь, находящаяся у ?-глюкозидного углеродного атома остатка фруктозы в молекуле сахарозы.
Метод основан на использовании редуцирующих свойств глюкозы и фруктозы, образующихся при гидролизе сахарозы, - способности восстанавливать окисную медь до закисной (метод Бертрана). Сумму редуцирующих гексоз выражают в глюкозном эквиваленте.
количественное определение глюкозы и фруктозы образовавшихся после гидролиза сахарозы можно определять с пикриновой кислотой (см. раздел «Анализ растений»).
346
Ход анализа
Навеску почвы 5 г помещают в колбу Эрленмейера на 50 см3. Добавляют пипеткой 10 см3 5%-го раствора сахарозы, приливают цилиндром 10 см3 ацетатного буфера (pH 4,7) и 0,5 см3 толуола. Закрывают колбу корковой пробкой, 3 мин взбалтывают на ротаторе и ставят в термостат при 37°С на 24 ч.
После инкубации реакционную смесь фильтруют в мерные колбы (емкость колбы зависит от количества продукта реакции - 100, 200 см3 и т.д.). Далее определение Сахаров ведут по одному из методов, описанных в разделе «Анализ растений». Определение Сахаров по методу Бертрана
Пипеткой отбирают 10-20 см3 фильтрата (в зависимости от активности инвертазы) в колбу Эрленмейера на 100 см3, сразу же приливают раствор Феллинга (если аликвота из раствора Сахаров 10 см3, добавляют 10 см3 4%-го раствора сернокислой меди и 10 см3 раствора сегнетовой соли; если аликвота 20 CMj, берут по 20 см3 сернокислой меди и сегнетовой соли), перемешивают и ставят на горелку или электроплитку и кипятят по песочным часам 3 мин.
С помощью водоструйного или масляного насоса фильтруют горячий раствор через трубку Аллина в колбу Бунзена.
Промывают колбу и трубку Аллина с осадком закисной меди от щелочи 7-8 раз горячей дистиллированной водой, не оставляя осадок закиси меди на воздухе. Трубку Аллина с промытым осадком переносят в малую колбу Бунзена, растворяют осадок 15-20 см3 раствора железо-аммиачных квасцов, приливая их сначала в колбу Эрленмейера, а затем в трубку Аллина. Колбу и трубку несколько раз промывают небольшими порциями горячей воды.
Раствор в колбе Бунзена титруют из бюретки 0,1 M раствором перманганата калия до слабо-розовой окраски.
Для расчета содержания Сахаров в объеме раствора, взятого для анализа, количество перманганата (с учетом поправки к титру) умножают на 6,36, так как 1 CMj 0,1 M KMnO4 эквивалентен 6,36 мг Cu2O. По весу закиси меди находят соответствующее количество глюкозы (см. таблицу 25 в ПРИЛОЖЕНИИ). Таким же способом определяют содержание глюкозы в контроле.
После внесения поправки на контроль рассчитывают активность инвертазы (X) в мг глюкозы на 100 г почвы за сутки:
х= а ?p 100 н
где а - количество глюкозы в объеме раствора, взятого для анализа за вычетом контролей (находят по таблице 25 в приложении), мг; р - разведение; н - навеска почвы, г.
347
Реактивы
1. 5%-й раствор сахарозы.
2. Ацетатный буфер (pH 4,7). «А» IM раствор уксусной кислоты; «Б» IM раствор CH3COONa - 136,09 г соли растворяют в 1 дм" дистиллированной воды. Растворы «А» и «Б» смешивают в равных количествах.
3. Раствор Феллинга. Приготовление см. В ПРИЛОЖЕНИИ.
4. Раствор железоаммонийных квасцов: 86 г железоаммонийных квасцов растворяют в воде и приливают 108,7 см3 концентрированной H2SO4, доводят объем до 1 дм3.
5. 0,1 M титрованный раствор KMnO4: 3,161 г перманганата калия растворяют в дистиллированной воде и доводят водой в мерной колбе до 1 дм". Реактив годен для использования через несколько дней.
Колориметрический метод определения количества глюкозы Ход анализа
Пипеткой помещают 6 см3 фильтрата в большую пробирку. Добавляют пипеткой 3 см3 50%-го раствора сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый), 3 см3 4%-го раствора сернокислой меди, перемешивают.
Пробирку с раствором нагревают на кипящей водяной бане 10 мин, охлаждают, содержимое переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют 7 мин при 3000 тыс. об./мин.
Колориметрируют при длине волны 630 нм в кюветах шириной 10 мм.
Количество глюкозы в мг находят по калибровочному графику.
Исходный стандартный раствор: содержит 1 мг глюкозы в 1 см" дистиллированной воды.
а- и ?-Амилазы (а-Амилаза: а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза. КФ 3.2.1.1; ?-Амилаза: рТ-1,4-глюкан-мальтогидролаза. КФ 3.2.1.2)
Ферменты амилазы осуществляют гидролиз крахмала, который входит в состав органических остатков, попадающих в почву, с образованием декстринов и мальтозы.
В природе встречаются два типа амилаз: а-амилаза гидролизует а-1,4-глюкановые связи в полисахаридах (крахмале, гликогене и родственных поли- и олигосахаридах, содержащих три или более остатков d-глюкозы, соединенных а-1,4-связями); ?-амилаза гидролизует ?-1,4-глюкановые связи в полисахаридах (крахмале, гликогене и родственных поли- и олигосахаридах), последовательно отщепляя остатки мальтозы и образуя путем инверсии ?-мальтозу.
