Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
После инкубации суспензию из пробирок несколькими порциями дистиллированной воды переносят в мерную колбу на 50 см", доводят до метки, перемешивают и фильтруют в другую мерную колбу на 50 CMJ, снова доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают. Если вытяжка мутная, добавляют 1 см" насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов.
332
Далее определение ведут по методу Грандваль-Ляжу. Помещают 20 CMj фильтрата в фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане до 1 капли (при пересушивании сухого остатка могут быть потери нитратов). Пипеткой прибавляют 1 см" дисульфофеноловой кислоты и тщательно растирают сухой остаток небольшой стеклянной палочкой. Через 10 мин в чашку приливают 15 см3 дистиллированной воды, перемешивают, опускают в раствор кусочек лакмусовой бумаги. Приливают из бюретки 20%-й раствор щелочи до окрашивания лакмусовой бумаги в синий цвет. При этом образуется комплексное соединение желто-оранжевого цвета. Если раствор помутнеет, добавляют еще 2-3 капли щелочи. Содержимое чашки через небольшую воронку без фильтра количественно переносят в мерную колбу объемом 50 см3. Доводят раствор водой до метки, закрывают пробкой, взбалтывают.
Раствор можно сразу колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром.
Количество нитратного азота в растворе находят по стандартной кривой, составленной на перекристаллизованный азотнокислый калий.
Активность нитратредуктазы (X) выражают в миллиграммах восстановленного NO3 "на 10 г почвы за сутки: X = ———О-Л—19—
н
где а - количество NO3, содержащееся в субстрате, мг; б - содержание NO3, обнаруженное после инкубации почвы с субстратом, по графику, мг; р - разведение; 10 - пересчет на 10 г почвы; н - навеска почвы, г.
Разница между количеством NO3, внесенного в почву в составе субстрата (1 CMj 1%-ГО KNO3 содержит 6,13 мг NO3) и определенного в реакционной смеси, равна количеству восстановленного нитратного азота.
Реактивы.
1. 1% раствор KNO3- 1 г соли растворяют в 99 см" дистиллированной воды.
2. Запасной образцовый раствор KNO3 с содержанием N-NO3 0.01 мг/см". Приготовление см. на с. 318.
Рабочий раствор готовят разведением запасного раствора в 50 раз. Рабочий раствор содержит 0,002 мг N-NO3 в 1 см". Его используют для приготовления шкалы.
3. Дисульфофеноловая кислота: приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
4. 20%-й раствор KOH или NaOH: 20 г сухого реактива растворяют в 80 см" воды.
Нитритредуктаза (НАД(Ф) • H2: нитрит-оксиредуктаза. КФ 1.6.6.4)
В результате действия нитритредуктазы нитриты превращаются в гидроксиламин и в гидрат окиси аммония. Нитриты образуются в почве в начальной стадии восстановления нитратов:
7 НАД(Ф) ?H+2NO2 =7 НАД(Ф) + 2 NH4OH + 2 H2O.
333
Принцип метода основан на способности нитритов образовывать с реактивом Грисса (смеси сульфаниловой кислоты и нафтиламина) соединение, окрашивающее раствор в красный цвет. Количественный учет нитритов производится с помощью калибровочной номограммы.
Ход анализа
На технических весах берут навеску почвы 1 г и помещают в пробирку на 25 CMj. В пробирку прибавляют 20 мг CaCO3, перемешивают. Приливают пипеткой 1 см" 0,5%-ГО раствора NaNO2 (субстрат для фермента) и 1 см3 0,1 M раствора глюкозы в качестве донора водорода.
Пробирки ставят в анаэростат, воздух из него медленно откачивают вакуумным насосом до разрежения 0,9-1,0 атм. Анаэростат с пробирками помещают в политермостат на 24 ч при 37°С. После инкубации медленно открывают анаэростат. Содержимое пробирок переносят дистиллированной водой в мерные колбы на 50 см3. Добавляют 1 CMj насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов, перемешивают, фильтруют через плотный фильтр. Пипеткой берут 1 см" фильтрата в мерную колбу на 50 CMj, цилиндром прибавляют 5 CMj дистиллированной воды, добавляют 4 CMj реактива Грисса. Колбу доводят водой до метки, перемешивают и колориметрируют через 15 мин с зеленым светофильтром в кюветах шириной 5 мм.
Количество нитритов определяют по предварительно составленной калибровочной кривой. Затем по разности между количеством нитрита, внесенного в инкубационную смесь (33,3 мг) и обнаруженного в фильтрате рассчитывают количество восстановленного субстрата.
Активность нитритредуктазы выражают в миллиграммах восстановленного NO2 на 1 г почвы за сутки.
Реактивы
1. 0.5%-й раствор NaNO2: 0.5 г соли растворяют в 99,5 CMj воды.
2. 0.1 M раствор глюкозы: Ir глюкозы растворяют в 100 см3 воды.
3. Насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов.
4. Реактив Грисса, приготовление см. в ПРИЛОЖЕНИИ.
5. Стандартный раствор NaNO2: 0.15 г высушенной при 70-800C соли растворяют в 1 дм" свободной от нитритов воды. 1 см" этого раствора содержит 0,1 мг NO2-ионов. При хранении в холодильнике раствор устойчив в течение месяца. Для приготовления рабочего раствора берут 25 см" стандартного раствора и разводят водой в колбе на 500 см". Полученный раствор содержит 0,005 мг N02-HOHOB в 1 см".
Ферриредуктаза (восстановленный НАД(Ф): Fe2O3 -оксидоредуктаза. КФ 1.6.99)
Ферриредуктаза осуществляет перенос водорода, мобилизованного дегидрогеназными системами НАД (Ф) • H2, на кислород окиси железа, восстанавливая его в закисную форму:
