Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
Снайдер [54] описал ряд элюентов (табл. VI.5), который перекрывает тот же диапазон элюирующей силы и включает только растворители, полностью прозрачные в УФ-области. Следует отметить, что чувствительные УФ-детекторы одновременно измеряют разницу показателей преломления. Поэтому при использовании ряда Снайдера
10 Заказ 825
146
Глава VI
Рис. VI.16. Градиентное элюирование [31].
Неподвижная фаза: силикагель: био-сил А; элюент: см. табл. VI.5; колонка 50 см х 2 мм (внутр.);
F ш 0,5 мл/мин.
Проба: 1 - сквалан; 2 - антрацен; 3 - метилстеарат; 4 - бензофенон; 5 - хлоранилин; 6 — нитроанилин; 7 — л-диннтробензол; 8 — я-ннтрофенол; 9 — дегндрохолестерин; 10 — катехол; // — фенацетин; 12 — аде-нин; 13 —фенолфталеин; 14 — EEDQ; 15 — хинин; 16 — ацетилсалициловая кислота; 17 — бензойная кислота; 18 - ВОС-лейцин; 19 — ВОС-глицин; 20- алаиин; 21 — глюкоза.
следует учитывать дрейф нулевой линии. Кроме того, при использовании этого ряда может наступить расслоение фаз.
Члены ряда элюентов в табл. VI.6 выбраны таким образом, что различие в элюирующей силе е0 (см. разд. 1.Г.1) между отдельными смесями составляет точно 0,05 единицы. Согласно Снайдеру [54], к' пробы уменьшается при этом в 2—4 раза. В этом ряд элюентов Снайдера аналогичен ряду Скотта (см. табл, VI.4).
Проводить многоступенчатое градиентное элюирование можно только на таких приборах, которые позволяют приготавливать смеси различной элюирующей силы (градиенты) в той части насоса, где давление низкое. При этом необходимы непрерывно работающие насосы; объемы коммуникаций между местом, где готовятся градиенты, и началом колонки должны быть очень малыми.
На большинстве же приборов для градиентного элюирования в жидкостной хроматографии при высоком давлении можно готовить градиенты только из двух элюентов. Градиентное элюирование усложняется из-за различия в вязкости используемых растворителей, различия в сжимаемости и неидеального поведения смесей. Выбранная система элюентов должна быть испытана на воспроизводимость приготовления градиентов и постоянство подачи при заданной программе.
Адсорбционная хроматография
147
Смешивание двух элюентов проводят по различным программам. Увеличение концентрации второго компонента во времени может описываться вогнутой, линейной или выпуклой кривой. Предпочтительна, конечно, линейная градиентная кривая. Действительный, т. е. эффективный, градиент зависит не только от программирования состава смеси, он всегда является функцией различия полярностей или элюирующих сил обоих компонентов. Если смесь приготавливают из двух элюентов, значительно различающихся по элюирующей силе, то уже незначительные количества второго компонента вызывают резкое увеличение элюирующей силы, т. е. фактическая градиентная кривая имеет выпуклую форму.
Такая форма кривой обычно нежелательна, так как с самого начала разделения компоненты элюируются почти неразделенными сразу друг за другом. Кроме того, из-за расслоения смеси элюента появляются также эффекты вытеснения, аналогичные описанным в разд. 3 а. Примером таких смесей могут служить смеси н-гексана и спирта, например изопропанола, взятого в количестве нескольких процентов. При линейном программировании примерно линейное увеличение элюирующей силы получают, только если полярности смешиваемых компонентов различаются лить незначительно. К такого типа смесям относятся смеси н-гексан — хлоралканы (хлористый пропил, хлористый метилен и т. д.), применяемые в системах с полярными неподвижными фазами, а также смеси вода — метанол (или, что также иногда допускается, ацетонитрил), применяемые в системах с неполярными неподвижными фазами.
Между прочим, слишком большое различие в полярностях проявляется в том, что при проскоке второго компонента на хроматограмме появляется очень большой пик: одновременно элюируются (без разделения) несколько соединений. Рис. VI.17 показывает многоступенчатое градиентное элюирование с переходом от гептана к ди-хлорметану и далее к смесям дихлорметана с изопропанолом. Вскоре после смены растворителей (замедление градиента, вызванное разделительной колонкой) элюируется большой пик (прежде всего в тех случаях, когда в смеси содержится избпропанол). Эта зона содержит сразу несколько соединений, которые в дальнейшем можно разделить с использованием подходящих систем.
Сведения о продолжительности отдельных ступеней градиентного элюирования или о количестве элюента, необходимом для одного шага программы, указать очень трудно, так как при этом необходимо учитывать длину разделительной колонки, или объем пустот в насадке, скорость потока и т. д. Авторы работы [53] показали, что при ступенчатом градиентном элюировании нельзя, удвоив длину колонки (удвоение объема пустот), просто увеличивать вдвое продолжительность ступени элюирования. В каждом конкретном случае необходимо определять свои подходящие параметры. При этом можно исходить из эмпирической зависимости [53], согласно которой
10*
148
Глава VI
Рис. VI. 17. Многоступенчатое градиентное элюирование масла перечной
мяты [56].
