Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Полное количество фосфорилхолина, присоединенного к матрице, определяют по содержанию фосфата. Для матрицы, полученной при отношении Gly-Tyr: активированная сефароза, равном 35 мкмоль: 10 мл, содержание фосфата составляло 1,0¦1O-3 моль/л. Функциональную емкость измеряют путем насыщения 0,1 мл замещенной смолы 2 мг мономера IgA, содержащего радиоактивно меченные антитела в качестве изотопного индикатора. Колонку промывают солевым фосфатным буфером, содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, до полного удаления несвязавшегося белка. Антитела, специфически связавшиеся с колонкой, элюируют буфером^, содержащим 10~3 моль/л фосфорилхолина. Емкость фосфорилхолин-сефаро-зы по IgA-антителам, выраженная как количество элюированных на этой стадии антител, составляла 5*10~5 моль/л [9].
Для аналитического использования может быть получен более разбавленный гель; в этом случае на 10 мл активированной сефарозы берут 3,5 мкмоль Gly-Tyr. Его функциональная емкость составляла 9-Ю-6 моль/л [9]. Как эта разбавленная, так и описанная выше более концентрированная матрицы были использованы для аналитического элюирования, описанного в разд. 6.2.
Количественная аффинная хроматография
229
4.3.3. Метионил-тирозил-фенилаланил-аминоалкил-агароза. Нейрофизины
(группа кислотных белков с молекулярной массой 10 000 дальтон, первоначально выделенных из задней доли гипофиза) нековалентно связывают ней-ропептидные гормоны, окситоцин и вазопрессин. Интенсивные исследования показали, что в гормонах наиболее важную роль в белок-полипептидном взаимодействии играют N-концевые остатки из трех аминокислот (полуци-стин — N-концевая аминокислота, затем тирозин и либо фенилаланин в ва-зопрессине, либо изолейцин в окситоцине) [19]. Трипептидный амид Met-Tyr-Phe-амид — эффективный лиганд для гормонсвязывающего положения в нейро-физинах.
Показано, что конденсация трипептида (свободная кислота) с агароз-ным твердым носителем через аминоалкильную вставку приводит к эффективному и удобному аффинному адсорбенту, который можно использовать и в препаративной, и в количественной аффинной хроматографии нейрофизи-нов [4, 20].
Met-Tyr-Phe-аминогексил-агароза может быть получена в результате одностадийной реакции конденсации между /г-нитрофенилсульфенил-Met-Tyr-Phe (НФС-Met-Tyr-Phe) и ю-аминогексил-агарозой [20].
I) НФС-Met-Tyr-Phe (20 мг в 5,5 диоксана) добавляют к 5 мл (упакованный объем геля в воде) (о-аминогексилагарозы.
2) Для проведения реакции присоединения добавляют по 33 мкмоль ди-циклогексилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимида (1 мкмоль/мкл в ДМФА).
3) Через 20 ч при комнатной температуре замещенный гель отфильтровывают и промывают последовательно смесью диоксан — вода (1:1, об./об.), метанол — вода (1 : 1, об./об.), водой, 1,0 M NaCl и водой.
4) Полученный желтый сорбент суспендируют в 0,2 M ацетате аммония (pH 5,2), содержащем 0,2 моль/л тиосульфата натрия, и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре для удаления НФС-защитной группы с концевой аминогруппы пептида.
5) Гель отфильтровывают и промывают водой, метанолом, водой, смесью ДМФА — вода (1:1, масс/об.) и водой.
Аминокислотным анализом матрицы, полученной по приведенной выше методике, установлено, что 0,85 мкмоль Met-Tyr-Phe-трипептида присоединилось к 1 мл упакованного геля.
Для аналитических экспериментов, описанных в разд. 6.3, использовали аффинные матрицы с установленной аминокислотным анализом концентрацией иммобилизованного лиганда, равной 0,59 и 0,30 ммоль/л для Met-Tyr-Phe-амнногексил- и аминобутил-агарозы.
4.3.4. БНФ-П-сефароза. В дополнение к лиганд-связывающей активности нейрофизинов (как описано выше), это семейство белков обладает также свойством самоассоциировать с образованием димеров из мономерных субъединиц. Это взаимодействие было изучено количественно методом аффинной хроматографии с использованием матрицы, представляющей собой бычий нейрофизин II (БНФ-Н), присоединенный к сефарозе [4, 21, 22]. Сорбент БНФ-И-сефароза может быть получен в результате одностадийной реакции между CNBr-активированной сефарозой и БНФ-Н в 0,1 M бикарбонате натрия (pH 8,5), содержащем 0,5 моль/л хлорида натрия, при осторожном перемешивании в течение ночи при 4 °С. Полученный гель промывают буфером для присоединения и перемешивают с 1,0 M этаноламином в том же буфере в течение 3 ч при комнатной температуре, затем промывают буфером для присоединения и 0,1 M ацетатом, содержащим 1 моль/л хлорида натрия (pH 3,5). Замещенная матрица для аналитического эксперимента, описанного в разд. 6.4, была получена взаимодействием 1 г активированной сефарозы с 5 мг БНФ-П и содержала по данным аминокислотного анализа 1,4 мг БНФ-Н/мл упакованного геля.
230
Глава 7
5. приготовление образцов ДЛЯ количественной
аффинной хроматографии.
КОНТРОЛЬ ЭЛЮИРОВАНИЯ
5.1. Приготовление образцов и введение радиоизотопной метки
5.1.1. Общие замечания. Образцы, используемые для количественной аффинной хроматографии, должны быть высокоочищен-ными и поэтому перед аналитической хроматографией их часто подвергают очистке путем препаративной аффинной хроматографии. Кроме того, приготовление образца имеет специфические особенности для конкретной системы. В случаях когда чувствительный анализ (например, ферментативная активность или радиоиммуноанализ) для определения подвижного компонента не может быть применен, следует отдать предпочтение введению радиоизотопной метки. Основными критериями для выбора метода введения радиоизотопной метки в подвижный компонент являются достижение достаточного уровня радиоактивности, позволяющего проводить последующее детектирование небольших количеств компонента, содержащихся в элюате, а также сохранение биоспецифической природы связывания меченых молекул. Наиболее распространенные методики введения метки в белки основаны на использовании 125I (который вводится путем обработки Ы-сукцинимидил-3-(4-гидрокси-5-[1251]иодо-фенил) пропианатом [23]) и трития (восстановительное метилирование [24] и [14с]карбамилирование [25]).
