Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Количественная аффинная хроматография
221
не следует менять физическую форму колонки, объем емкостей буферов, заменять инжектор для введения образца, соединительную трубку, детектор и коллектор фракций.
5) Полный объем колонки V0 определяют при элюировании вещества, молекулы которого достаточно небольшие по размеру и проникают в гель в той же степени, что и молекулы подвижного компонента; однако это вещество не должно проявлять специфического сродства к иммобилизованному лиганду. Для анализов взаимодействий небольших белков на аффинных сорбентах на основе агарозы, аналогичных описанным ниже, для определения IZ0 была использована панкреатическая рибонуклеаза быка или другой подобный белок.
6) Исключающийся объем колонки Vm определяют при элюировании больших, не проникающих в гель молекул; для сорбентов на осйове агарозы часто использовали голубой декстран.
7) Небиоспецифические взаимодействия (например, образование ионной пары между подвижным компонентом и матрицей), приводящие к нежелательному дополнительному удерживанию, должны быть исключены соответствующим выбором буфера и условий проведения эксперимента [5]. Природа неспецифического взаимодействия определяет в конечном счете условия, необходимые для его исключения.
8) На колонку обычно вводят образец в небольшом объеме, как правило, <100—400 мкл для колонок с объемом адсорбента 1—10 мл.
9) Содержание белка в зоне, введенной в колонку, должно быть минимальным (разд. 3.1). Для проведения анализов с зональным элюированием, когда работают с очень небольшими количествами подвижного компонента, преимущественно используют чувствительные методы детектирования, такие, как определение радиоактивности, радиоиммунный и ферментативный анализ.
10) Объемы элюирования могут быть определены визуально методом триангулирования основного пика. В случае когда не-связавшиеся примеси элюируются с полным объемом колонки Vo и определяются с помощью подходящего метода, полученный пик обычно не учитывают, если он не влияет на анализ задерживаемого пика подвижного компонента биоспецифической системы (объем элюирования близок V0). Компьютерная обработка данных элюирования для определения объемов элюирования является надежной альтернативой метода триангулирования.
222
Глава 7
3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КРИВЫХ ЭЛЮИРОВАНИЯ ДЛЯ РАСЧЕТА КОНСТАНТ РАВНОВЕСИЯ
3.1. Моновалентные системы
Запишем реакции конкурентного моновалентного связывания (рис. 2)
P + L 3=fc PL
(О
- *L -
P+L -?-PL
где P —подвижный компонент, L —лиганд, иммобилизованный на матрице, L — растворимый компонент, конкурирующий с L за связывание с Р; PL и PL — нековалентные комплексы между соответственно подвижными и иммобилизованными компонентами системы; Kh и /C1 — константы диссоциации для PL и PL. В настоящем обсуждении, как правило, P — макромолекула (например, белок), a L и L — низкомолекулярные лиганды, связывающиеся с одним и тем же активным центром Р. Тем не менее обсуждаемые уравнения^ также пригодны и для других случаев, например когда и P и L — макромолекулы.
Основываясь на уравнениях (1) и учитывая общие положения жидкостной хроматографии с взаимодействующими компонентами [1, 2, 6], можно вывести зависимость:
--+-- (2)
V-Vo (V0-V7n) [L] KL(V0-Vm) [L]
Это выражение устанавливает связь между изменением экспериментально измеренного объема элюирования подвижного компонента и концентрациями иммобилизованного и растворимого конкурирующих лигандов [L] и [L], а также константами диссоциации /О/ и /Cl. Для систем с моновалентным взаимодействием с помощью уравнения (2) можно определить /Cl и Kh непосредственно по хроматографическим данным. Для специфической аффинной матрицы с_фиксированной концентрацией иммобилизованного лиганда [L] проводится ряд экспериментов с изменяющимися значениями [L] в элюирующем буфере. Объемы элюирования зон подвижной макромолекулы определяются при различных значениях [L]. Строят зависимость 1/(V—V0) от [L]. Тогда Kl можно найти по тангенсу угла наклона прямой, a ^l — по отсекаемому отрезку на оси ординат. /Cl и Kl можно рассчитать также аналитически, обработав полученные данные по элюированию линейным методом наименьших квадратов.
Количественная аффинная хроматография
223
[L] (разд. 4.2), vo и vm определяются для данной матрицы и физических параметров колонок.
В некоторых случаях может быть желательно или необходимо проводить зональное элюирование в отсутствие конкурирующего растворимого лиганда ([L]=O). В этом случае уравнение (2) упрощается:
V-V0 (V0-Vm) [L]
В отсутствие конкурирующего лиганда [L]=O, тогда Kl пропорциональна 1/(V-Vq). Таким образом, для матрицы с постоянным значением [L], использованной для конкурентного зонального элюирования, Kl можно достаточно надежно найти по одной кривой элюирования.
Важное условие зональной аналитической аффинной хроматографии состоит в том, что концентрация подвижного компонента [P] по мере прохождения зоны через слой адсорбента постоянно изменяется. Поэтому члены, содержащие [P], не включаются в выражения, относящиеся к объемам элюирования и константам диссоциации (см., например, приведенные выше уравнения). Пренебрежение [P] допустимо только в том случае, если этот параметр мал по сравнению с константой диссоциации кь- Проведение экспериментов по зональному элюированию при низком [P] обычно легко осуществимо и особенно желательно при анализе труднодоступных биомолекул. Использование низких [P] в зональном анализе аналогично применению низких концентраций фермента в твердофазном ферментативном кинетическом анализе [7]. Было экспериментально показано (например, в работе [5]), что при низком (по отношению к Kl) количестве фермента, введенного в аффинную матрицу, рассчитанные константы диссоциации практически не зависят от количества использованного подвижного компонента. В то же время в работе [8] предложены уравнения расчетов по методу постоянного элюирования/фронтального анализа, в которые входит точное значение концентрации подвижного компонента, нанесенного на аффинную колонку (см. также гл. 6). С практической точки зрения метод зонального элюирования экспериментально более удобен и требует гораздо меньшего количества подвижного компонента. Таким образом, зональное элюирование, по-видимому, наиболее подходящий метод для изучения большинства взаимодействий, представляющих биологический интерес. Следовательно, существует необходимость в чувствительных аналитических методах для проведения элюирования и детектирования малых количеств подвижного компонента.
