Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
б) В случае метода неспецифического элюирования колонку промывают уравновешивающим буфером, содержащим 1,0 моль/л KCl.
Предложен [55] поперечно-сшитый бисакриламидный гель, к которому через полиакриламидные цепочки различной длины ковалентно присоединены красители, специфичные к основаниям нуклеотидов.
На основе специфичности к парам азотистых оснований иммобилизованные (AT)-специфичный малахитовый зеленый и (GC)-специфичный фениловый красный нейтральный используются при фракционировании ДНК из бактерий или млекопитающих, а также могут быть применены для разделения определенных фрагментов фаговой ДНК.
Гели с иммобилизованными акридином желтым ED или фе-ниловым красным нейтральным проявляют специфичность к структуре и могут быть использованы для специфичных разделений суперспиральной ДНК от других нативных форм ДНК — открытой кольцевой или линейной [56].
7.2. Хроматография ДНК на бисакриламидах
с иммобилизованными красителями. Общая методика
7.2.1. Предварительная обработка геля и упаковка хроматогра-фической колонки.
1) Гель (20 г) суспендируют в —10 объемах 10 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 1 ммоль/л ЭДТА (pH 6,0).
2) После осаждения геля слегка мутный супернатант декантируют и материал вновь суспендируют в том же буфере.
3) После повторения этой операции по крайней мере 3 раза гель переносят в хроматографическую колонку подходящего размера (1,2x22 см, -25 мл) и промывают 2,0 M перхлоратом натрия в 10 мМ натрийфосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 1 ммоль/л ЭДТА.
4) Через колонку пропускают два (колоночных) объема 10 мМ натрийфосфатного буфера (pH 6,0), содержащего 1 ммоль/л ЭДТА. При промывании 2,0 M перхлоратом удаляются мелкие частицы геля, содержащего краситель (которые ухудшают скорость потока через колонку).
7.2.2. Аффинная хроматография.
1) Наносимая на колонку ДНК должна быть предварительно очищена от белковых примесей.
176
Глава 5
2) ДНК растворяют в 10 мМ натрийфосфатном буфере, содержащем 1 ммоль/л ЭДТА (pH 6,0); концентрация раствора 50—100 мкг ДНК/мл (что соответствует Аш= 1-ь-2). Раствор наносят на колонку. Максимальная емкость гелей составляет — 40 мкг ДНК/мл упакованного геля (Л2бо = 0,8).
3) После промывания колонки несколько раз тем же буфером элюируют ДНК линейным градиентом перхлората натрия (0-^2,0 моль/л) в 10 мМ натрийфосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 1 ммоль/л ЭДТА. Оптимальная скорость потока составляет 10—15 мл/ч; собирают фракции по 5—8 мл.
В некоторых случаях при элюировании суперспиральной ДНК с гелей, специфичных к структуре, может возникнуть необходимость увеличения концентрации перхлората до 5,0 моль/л (также в натрийфосфатном буфере, pH 6,0, содержащем ЭДТА).
7.2.3. Регенерация и хранение. Колонки с аффинными адсорбентами могут быть регенерированы и без ограничений использованы повторно. Для регенерации гели промывают (по крайней мере 2 объемами колонки) 5,0 M перхлоратом натрия в 10 мМ натрийфосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 1 ммоль/л ЭДТА, и затем (несколькими объемами колонки) 10 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 1 ммоль/л ЭДТА (pH 6.0). Хранят колонки в темноте при комнатной температуре.
Внимание! Следует обратить внимание, что регенерация геля с малахитовым зеленым осуществляется при pH 6,0 или ниже. При рН>6,0 основание малахитового зеленого будет превращаться в бесцветное карбинольное основание, которое не проявляет сродства и специфичности к ДНК [57].
Гели аффинных адсорбентов, особенно содержащие фенило-вый красный нейтральный, чрезвычайно чувствительны к свету. Поэтому следует позаботиться о том, чтобы не подвергать колонки действию света, даже в процессе хроматографии, например обернуть колонки алюминиевой фольгой.
7.2.4. Применение. (AT)-специфичный гель с малахитовым зеленым и (GC)-специфичный гель с фениловым красным нейтральным могут быть использованы для аффинной хроматографии двуспиральной ДНК, основанной на специфичности к парам азотистых оснований. Для специфичного к основаниям разделения ДНК выбирают гель, с которого желаемая фракция ДНК элюируется первой, т. е. для выделения (AT)-обогащенной са-теллитной ДНК используется гель с фениловым красным нейтральным, а для выделения (GC)-обогащенной ДНК из тимуса теленка — гель с малахитовым зеленым (АТ-специфичный).
Так, гель с иммобилизованным малахитовым зеленым был успешно применен для разделения сателлитной и хромосомной
Лиганды для иммобилизации
177
ДНК из Halobacterium halobium [59] и для разделения три-плексов поли(аА) • (dT) • (rU) и поли(аА) .2(rU) [63], гель с фениловым красным нейтральным был использован для получения фракционированной по размеру ДНК нематоды [60] для экспериментов по клонированию.
Разрешающая способность этого метода аффинной хроматографии для нуклеиновых кислот в большинстве случаев превосходит результаты фракционирования ДНК в градиенте плотности в присутствии лигандов, специфичных к парам оснований.
Гели с акридиновым желтым или фениловым красным нейтральным удобны для структурно-специфического разделения суперспиральной ДНК от открытой кольцевой или линейной ДНК, поскольку эти красители образуют комплексы включения с энергетически выгодной суперспиральной ДНК [56, 62].
