Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
За единицу активности протеинкнназы принималось количество фермента, катализирующее перенос 1 пкмоля концевой группы [32P]ATP на белковый субстрат за 1 мин при 37 0C Одна единица активности РНК-полимеразы соответствовала включению ] пкмоля UMP в РНК за 1 мин при 30 °С.
^ Из-за присутствия нуклеаз и фосфатаз полная активность исходного гомогената по данному ферменту значительно ниже.
в Фракция, элюированная с гепарин-агарозы 300 мМ (NH^sSO*, была нанесена на колонку с казеин-агарозой.
Лиганды для иммобилизации
167
По этой методике можно выделить:
а) гистонкиназу (элюирована в исключающемся объеме);
б) казеинкиназу и минорную фракцию РНК-полимеразы (элюируются буфером В);
в) основные количества РНК-полимеразы ( — 60% полной активности; элюируется буфером Г; см. табл. 10 и рис. 10).
Если вместо ступенчатого градиента используют линейный градиент соли, то РНК-полимераза вновь дает два пика на кривой элюирования, т. е. получение двух пиков фермента не вызы-
Рис. 10. Разделение РНК-полимеразы и протеинкиназ на колонке с гепарин*
сефарозой.
вается перегрузкой колонки или неправильным выбором ступенчатого градиента.
5Л.2. Комбинация бетч- и колоночного методов для гепарин-се~ фарозы. Для ускорения наиболее продолжительных стадий процесса (связывание ферментов с гепарин-сефарозой и промывание колонки, стадии 1-г-5) может быть применен бетч-метод, который следует также использовать при работе с большими количествами вещества.
1) Гепарин-сефарозу (20 г) уравновешивают буфером Б до достижения в элюате соответствующей электропроводности.
2) Быстро доводят электропроводность исходного раствора ферментов до уровня буфера Б путем разбавления буфером А.
168
Глава 5
3) Приливают раствор ферментов к уравновешенной гепарин-сефарозе и оставляют на 1 ч при осторожном перемешивании; суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин.
4) Супернатант отделяют, приливают к гелю буфер Б (70 мл) .и осторожно перемешивают. Суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин и супернатант отбрасывают.
5) Гель промывают буфером Б (3 раза по 70 мл).
6) Гель суспендируют в —15 мл буфера Б, суспензию выливают в колонку (1,6x20 см) и дают гелю осесть на —5 см.
7) После прохождения через колонку 15 мл буферного раствора на колонку с помощью перистальтического насоса подают буфер Б со скоростью потока 16—20 мл/ч.
8) Собирают фракцию элюата между 13 и 23 мл, соответствующую белковому пику.
9) Применение бетч-процесса уменьшает продолжительность лабораторной работы с двух дней до одного и обеспечивает разделение ферментов, как и колоночный метод. Однако выход и степень очистки оказываются на —30% ниже, чем при использовании колоночного метода.
5.5. Методика хроматографии на казеин-сефарозе
Фракция, элюированная с гепарин-сефарозы буфером В, содержит основную казеинкиназную активность и некоторое количество РНК-полимеразной активности (рис. 10). Для разделения и дальнейшей очистки этих ферментов может быть использована хроматография на казеин-сефарозе. Наиболее существенно удалить избыток соли из указанной фракции (содержащей 300 мМ (NH4)2SO4), что можно осуществить диализом в течение ночи в буфере Д (3 раза по 500 мл).
1) После диализа образец центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 об/мин и осадок отбрасывают.
2) Колонку (0,9X30 см) при 4 °С заполняют влажной агаро-ж>й (10 г); дают гелю осесть на —3 см.
3) После прохождения через колонку 8 мл буферного раствора на колонку с помощью перистальтического насоса подают .100 мл буфера Д со скоростью потока 16—20 мл/ч.
4) На колонку наносят раствор ферментов (после диализа) и собирают первый объем, прошедший через колонку.
5) Колонки промывают буфером E (20 мл), буфером Ж (20 мл), затем буфером 3 и собирают элюат между 16 и 35 мл буфера 3.
При хроматографии в описанных выше условиях РНК-поли-мераза не связывается аффинным сорбентом и не удерживается на колонке, а элюируется в исключающемся объеме, в то время как прочно связанная казеинкиназа десорбируется с колонки
Лиганды для иммобилизации
169
только буфером 3 с высокой ионной силой (рис. 11). В результате хроматографии достигается разделение киназной и полиме-разной активностей со значительной очисткой казеинкиназы и значительным повышением ее удельной активности (табл. 10).
Замечание. Упаковку и уравновешивание колонки следует проводить за день до проведения стадии разделения.
5.6. Характеристика РНК-полимеразных фракций, выделенных с колонки с гепарин-сефарозой
Первая фракция РНК-полимеразы элюируется с колонки буфером В, содержащим 300 мМ (NH4)2S04, а вторая — буфером Г, содержащим 600 мМ (NH4)2SO4. Основные критерии классификации РНК-полимеразы заключаются в чувствительности к а-аманитину и в порядке элюирования с ионообменников [50]. Первая фракция РНК-полимеразы устойчива к а-аманитину при концентрациях до 400 мкг/мл, в то время как вторая фракция ингибируется на 60% при концентрации 0,1 мкг/мл. Co-
20 40 60 80 100 120 мл
Рис. 11. Разделение РНК-полимеразы I и казеинкиназы на колонке с ка-зеин-сефарозой 4В. 1—концентрация белка; 2 — РНК-полимераза; 3 — ка-
