Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
3) через 1 мин после добавления ПЭГ в пробирку вносят 1 мл теплой культуральной среды без сыворотки, перемешивают ПЭГ со средой, покачивая пробирку; 4) через 1 мин добавляют еще 2 мл культуральной среды и перемешивают; 5) через 1 мин культуральной средой доводят объем суспензии клеток до 10 мл, инкубируют при 37 °С еще 10 мин; 6) центрифугируют 5 мин при 700 g и комнатной температуре, ресуспензируют клетки в культуральной среде с 20 % сыворотки. Желательно, чтобы 1 /з—1 /2 культуральной среды была кондиционирована А или Б клетками-партнерами (например, в случае получения гибридом — клетками миеломы). Кондиционированная среда предварительно должна быть очищена от открепившихся клеток и клеточного детрита центрифугированием в течение 10 мин при 3000 g. Оптимальное время кондиционирования среды при исходной плотности посадки клеток 100 тыс./мл составляет 2—3 сут (о содержании клеток в среде при их посадке после слияния см. в методе 1.4, п. 7).
3.1. Электростимулируемое слия ние клеток. Далее мы рассмотрим некоторые наиболее универсальные методики электрослияния, применимые к культурам животных клеток. В них использованы различные способы приведения клеток в контакт. Выбор оптимального способа зависит от типа клеток, морфологии и свойств поверхности. Важен также учет некоторых факторов (воздействие переменного поля, пребывание в среде с низкой ионной силой при диэлектрофорезе) , способных повредить особо чувствительные клетки. Поскольку электрический пробой приводит к резкому, хотя и временному, неспецифическому увеличению проницаемости плазматических мембран, жизнеспособность клеток сильно зависит от состава среды, в которой проводится электрообработка. Чтобы сохранить в норме ионный состав внутри клетки, ее осуществляют предпочтительно в бескальциевой среде, содержащей калий в качестве основного катиона. Лишь в некоторых случаях [22] в среду добавляют не более 10~4 М Са2+. Содержащиеся в среде электрообработки 0.1—0.3 М сахара (сахароза, маннит или инозит) уменьшают ее электропроводность (и соответственно выделение тепла при протекании тока — закон Джоуля—Ленца), а также предотвращают коллоидно-осмотический лизис клеток после пробоя [23].
Предложенные модификации метода можно разделить на микро-и макроспособы в зависимости от тюго, с каким количеством клеток оперирует исследователь: микроспособы предполагают работу с одиночными или несколькими парами клеток, в то время как макроспособы не имеют принципиальных ограничений числа клеток и дают возможность обрабатывать до 108 клеток одновременно. Изложенные далее процедуры электрослияния приведены в достаточно общем виде, так что указаны не конкретные параметры электрообработки: число импульсов, напряжение (К), напряженность поля между электродами (?), длительность импульса (t или т), частота переменного поля (/), а лишь диапазоны, в которых следует отыскивать оптимальные параметры. Отметим, что для разных клеточных линий эти параметры могут варьировать в широких пределах.
3.2. Электрослияние с применением диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле: микроспособ [24]. При наложении неоднородного переменного поля на клетки, находящиеся в среде с низкой ионной силой, последние втягиваются в область максимальной напряженности поля (диэлектрофорез) и формируют характерные цепочки (см. рисунок, а). Наложение одиночных электрических импульсов на цепочки плотно контактирующих клеток непосредственно в ходе диэлектрофореза вызывает их слияние.
Установка, схема которой приведена на рисунке (б), состоит из генератора Г\ (ГЗ-7А или аналогичного), подающего синусоидальные колебания с частотой /=10 кГцЧ-2 МГц, амплитудой Епш до 30 В, подключаемого через реле генератора Г2 (Г5-54 или Г5-28), подающего прямоугольные импульсы К=0-г-70 В, ?=1-М00 мкс, и осциллографа (О) для контроля напряжения на электродах ячейки (Я). Микроячейка для диэлектрофореза (см. рисунок, в) монтируется на предметном стекле (<?) при помощи водостойкого клея и со-
-ч,
/ ч
1
Схема электростимулируемого слияния клеток и необходимое оборудование.
а — схема, иллюстрирующая диэлектрофорез клеток в неоднородном переменном электрическом поле, создаваемом двумя цилиндрическими электродами; б—блок-схема установки для диэлектрофореза и слияния клеток; в — конструкция микроячейки для слияния клеток по Циммерману; г — схема простого формирователя экспоненциально затухающих импульсов; д — схема формирователя квазипрямоугольиых импульсов; е — ячейки для слияния клеток в осадке после центрифугирования: / — тефлоновая ячейка, сужающаяся киизу и имеющая там небольшую (диаметром 3—4 мм) цилиндрическую полость, 2 — ячейка, изготовленная из кюветы от спектрофотометра. Пояснение см. в тексте.
стоит из спейсера (2) (плексиглас) и двух проволочных электродов (платина, никель или нержавеющая сталь) диаметром 0.2—
0.4 мм (2). Расстояние между электродами в рабочей части состав-
Продолжение рисунка
ляет 0.1—0.2 мм. Ячейку можно стерилизовать этанолом с последующим высушиванием под УФ-лампой, а в ходе эксперимента накрывать покровным стеклом.
