Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
33. Ионгкинд И., Веркерк А. Неселективное выделение гетерокариоиов, гибридов и цибридов между фибробластами методом сортировки в потоке // Методы генетики соматических клеток. М., 1985. Т. 1. С. 101 —121.
34. Райт В. Отбор гетерокариоиов и клеточных гибридов с помощью метаболических ингибиторов — йодацетамида и диэтилпнрокарбоната//Методы генетики соматических клеток. М., 1985. Т. 1. С. 62—85.
35. Наровлянский А. Н., Амченкова А. М., Щеглавитова О. Н., Хесин Я. Е. Выделение гибридов соматических клеток с помощью специфического интерферон-вирусного метода селекции // Вопр. вирусологии. 1985. Т. 30. С. 244—250.
Получение моноклональных антител
(гибридомная технология)
И. И. Ф р и д л я н с к а я
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
В процессе фундаментальных исследований механизмов синтеза иммуноглобулинов, проводимых с применением клеточных культур и гибридологического анализа, выявились закономерности, практическое применение которых произвело революцию в иммунологии [1]. Был найден подход, позволяющий получать практически в неограниченных количествах моноклональные антитела (МонАТ) с известной специфичностью. Суть новой технологии состоит в получении гибридов между клетками миеломы и нормальными В-лимфоцитами от доноров, иммунизированных определенными антителами. В таких гибридах (гибридомах), которые при культивировании «бессмертны», продуцируются гомогенные антитела против индивидуальных эпитопов антигена.
МонАТ являются новым поколением иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов. Благодаря им иммунологические методы стали шире использоваться в различных отраслях науки, даже в тех, где ранее применение иммунологических подходов было ограничено или они вовсе не использовались. Это определило интерес к гибридомной технологии многих исследователей, занимающихся решением научных и прикладных задач. Принципы метода, а также возможности применения МонАТ описаны в ряде обзоров [2-4].
Для получения МонАТ используют различные клеточные системы. Особое внимание уделяется получению гибридом человеческого происхождения, поскольку МонАТ, полученные на их основе, имеют первостепенное значение для клинического применения. В этом направлении имеются некоторые успехи [5]. Однако в настоящее время основной клеточной системой в гибридомной технологии являются клетки мышиного происхождения, поэтому подробное описание метода, которое будет дано ниже, касается только мышиных МонАТ.
Процедура получения МонАТ включает следующие этапы:
1) иммунизация; 2) слияние нормальных клеток от иммунизированных доноров с клетками миеломы, селекция гибридов (гибридом);
3) скрининг гибридом на продукцию специфичных МонАТ; 4) получение стабильных л и ний-продуцентов (клонирование); 5) характеристика МонАТ; 6) наработка МонАТ — культивирование in vivo и (или) in vitro; 7) криоконсервация клеток; 8) очистка антител.
Методы, используемые разными авторами на каждом из этапов, в деталях почти всегда несколько отличаются. Здесь будет описан вариант гибридомной технологии получения моноклональных антител, успешно применяемый в нашей лаборатории. Учитывая, что публикуемый сборник посвящен методам культивирования клеток, основное внимание будег уделено этапам работы, связанным с культивированием клеток. Подробно с методами, относящимися
к характеристике антител, а также к очистке антител, можно ознакомиться в ряде обзоров [2, 3, 6].
Иммунизация
Цель иммунизации — индукция клонов В-лимфоцитов, продуци-рующих антитела к определенному антигену. Для некоторых антигенов получение гибридом возможно без целенаправленной иммунизации, однако такая ситуация чрезвычайно редка.
Считается, что при образовании гибридом с клетками миеломы сливаются преимущественно делящиеся В-лимфоциты. Выход гибридом, продуцирующих специфические антитела, наибольший, если для слияния берутся клетки на 3—5-е сутки после бустерной иммунизации (в период активной антиген-индуцированной пролиферации В-лимфоцитов). Поэтому в подавляющем большинстве конечным этайом иммунизации является бустирование и забор клеток на 3— 5-е сутки после него [7]. Бустерные инъекции наиболее эффективны при внутривенном или внутрибрюшинном введении антигена.
Общее время иммунизации варьирует от нескольких суток (иммуноген—клетки) до нескольких месяцев (иммуноген—гаптены). При использовании в качестве антигенов растворимых белков при первичных иммунизациях применяются стимуляторы иммунного ответа (например, полный адъювант Фрейнда). Для иммунизации можно использовать мышей разных штаммов. Однако поскольку до сих пор основным методом получения МонАТ остается выделение их из асцитной жидкости, работают, как правило, с животными, сингенными в отношении миеломных клеток.
Ниже приводится схема иммунизации, которая может быть применена для растворимых белков (неслабых иммуногенов).
Сутки до слияния Доза антигена (мкг на мышь), способ
введения
15................... 100 подкожно с полным адъювантом
