Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
85. Gurney 7Vt, Woolf М., Alplanalp L. et al. Elimination of Mycoplasma hyorhinis infections from four cell lines // In Vitro. 1981. Vo!. 17. P. 993—996.
86. Смирнова Т. Д., Фридлянская И. И. Контаминация клеточных культур микоплаз-i мами: методы обнаружения и возможные пути распространения микоплазма-
инфекции // Цитология. 1985. Т. 27. С. 276—281.
•I Прижизненная люминесцентная микроскопия клеток
А. Д. Соркнн, Л. В. Тесленко
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Разнообразие методических подходов — характерная черта современной клеточной биологии. Одним из самых популярных методов изучения клетки является флюоресцентная микроскопия. Практически все клеточные компартменты можно изучать с помощью флюоресцирующих молекул. Большинство работ сделано на фиксированных клетках, особенно много данных получено методом иммунофлюоресценции, однако главным преимуществом люминесцентной микроскопии является возможность исследования различных, в том числе и количественных, характеристик многих процессов в живой клетке. С развитием систем усиления люминесцентного изображения клетки, позволяющих анализировать изображение
при значительном уменьшении интенсивности возбуждающего света, уровень и значимость исследований на живых клетках резко возросли и будут расти в ближайшее время. В качестве иллюстрации возможностей прижизненной флюоресцентной микроскопии можно привести ряд примеров использования этого метода в клеточной биологии.
Так, для исследования мембран и липидных включений применяются различные гидрофобные зонды нелипидной природы и липиды, меченные флюорохромами. С помощью таких зондов можно не только наблюдать распределение липидов в клетке, но и изучать динамические характеристики липидного бислоя в различных частях клетки [1, 2]. Существуют зонды для прижизненного измерения количества ДНК в клетке, например Hoechst-33342. Специфическим маркером митохондрий (только в живой клетке) является родамин. 123, отсутствие аккумуляции которого в митохондриях свидетельствует о гибели клетки. Синтезированы зонды, чувствительные к величине pH (флюоресцеин и его производные), к концентрации свободного Са2+ (квин-2, фура-2, индо-1), к величине мембранного потенциала. Хотя данные зонды используются значительно чаще для измерений на целых клеточных популяциях, известны работы, где изучалось распределение ионов Са2+ и ионов Н+ (величина pH) в отдельной клетке [3, 4]. Перспективными и все более популярными становятся исследования процессов после инъекции в клетку флюоресцентно меченных антител к какому-либо внутриклеточному антигену, например к белкам цитоскелета [5]. Для всех случаев существуют общие этапы в проведении экспериментов: 1) синтез и очистка флюоресцентного зонда или флюоресцентно меченной биомолекулы (флюоресцентного конъюгата); 2) изучение и проверка возможного влияния на клетку зонда или меченой молекулы, сравнение свойств конъюгата с немеченым аналогом; 3) изучение спектральных характеристик зонда или метки in vitro и в условиях возможного микроокружения в клетке и выбор на основе этого оптимальных условий и оптимальных комбинаций фильтров возбуждения и регистрации флюоресценции; 4) введение флюоресцентной молекулы в клетку и обеспечение физиологических условий при микроскопическом анализе; интенсивность возбуждающего света и время засветки должны быть минимальными, чтобы сохранить интактность клеток в течение эксперимента, регистрирующая система должна обладать максимальной чувствительностью; 5) при интерпретации результатов микрофотографирования или микрофотометрирования живых клеток при слабых сигналах необходимо учитывать собственную люминесценцию клеток, которая может быть различной как у разных клеток, так и в различных участках одной и той же клетки.
Флюоресцентная микроскопия широко используется для изучения процесса эндоцитоза в культивируемых клетках млекопитающих. Рассмотрим методы исследования рецептор-опосредованного эндоцитоза (РОЭ) различных лигандов в живых клетках. Этот процесс складывается из связывания лигандов с поверхностными рецепторами, поступления лиганд-рецепторных комплексов внутрь клетки
через окаймленные ямки (кластеризация и интернализация) и последующего транспорта лигандов и рецепторов в различные внутриклеточные компартменты. Заметим, что весь процесс может проходить за несколько минут.
Приготовление меченых лигандов
для нсследовання процессов эндоцитоэа
Для исследования механизма эндоцитоза" используют ряд флюоресцентно меченных лигандов, например конъюгат эпидермального фактора роста (ЭФР) с родамином, аг-макроглобулина (МГ) с родамином и флюоресцеином, трансферрина с флюоресцеином.
ЭФР, меченный родамином по концевой ЫНг-грулпе, получают следующим образом. 600 мкг ЭФР, содержащего ,251-ЭФР в следовых количествах, растворяют в 0,6i мл 0.2 М карбонатного буфера, pH 9.3,и добавляют 3 раза по;1!7<мкл 1 %-ного раствора тетраметил-родаминизотиоцианата (ТРИТТД, «Sigma») в диметилформамиде с промежутками в 3 ч при постоянном перемешивании при комнатной температуре. После окончания реакции материал подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-15, уравновешенном на воде. Фракции, содержащие немеченный и меченный родамином ЭФР (ЭФР-Р), собирают и подвергают анионообменной хроматографии на ДЕ-52 целлюлозе (колонка 5X1 см)',, уравновешенной на 0.02 М Трис-HCi, pH 7.6. ЭФР-Р отделяется от ЭФР при элюции градиентом NaCl (0—1 М). Молярное соотношение ЭФР и родамина в полученном конъюгате, определяемое по отношению активности 1251-ЭФР и оптическбй плотности при 545 нм, обычно составляет 1:1. Выход конъюгата — около 10% (подробнее см. [6]). Возможно, что выход конъюгата можно повысить, если вести реакцию в органическом растворителе, например в диметиясульфоксиде [7\>. Трансфер-рин метят флюоресцеином по стандартной методике с помощью флюоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ, «Serva») на частицах целита.
