Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
5. Охладить суспензию, поместив ее в сосуд со льдом (4°С); добавить 1.25 М раствор СаСЬ (0.25 мл на 2 мл исходной суспензии клеток) и 0.25 М раствор ЭДТА • Na2 (0.8 мл на 2 мл исходной суспензии клеток); разбавить суспензию, осторожно и при перемешивании добавляя 4 объема буфера Г (т. е. 8 мл буфера Г на 2 мл исходной суспензии); в полученной суспензии содержится обычно 5- 108—
1 • 109 протопластов в 1 мл.
6. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре, 1 мл суспензии (около 109 протопластов) добавить на 1 чашку диаметром 50 мм с клетками, клетки необходимо посеять за 18 ч до эксперимента, оптимальным является рассев 1 • 105—2 • 105 клеток на чашку диаметром 50 мм.
7. Осадить протопласты на клетки, центрифугируя чашки в течение 3—5 мин (при комнатной температуре); мы используем для этой
цели пластиковые контейнеры цилиндрической формы со съемным дном и крышкой, устанавливаемые непосредственно в подстаканники buckett-роторов центрифуг К23 или К70 («Janezki», ГДР) с помещенными в них чашками Петри.
8. Тщательно отсосать супернатант (поставив дно чашки на бок, дать стечь остаткам среды и вновь отсосать среду); добавить на чашку 1 мл 4$ %-ного раствора ПЭГ, и, наклоняя чашку, добиться равномерного распределения раствора по поверхности чашки.
9. Инкубировать 45—90 с при комнатной температуре, отсосать раствор ПЭГ и быстро промыть чашки 3—4 раза ростовой средой (по 5 мл) без сыворотки с 200 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина.
10. Добавить по 5 мл ростовой среды с 10 % СЭК и 200 мкг/мл гентамицина на чашку; в течение следующих 3 ч трижды сменить среду.
11. На следующие сутки поменять среду на селективную; при необходимости рассеять клетки на новые чашки Петри и спустя 5— 6 ч сменить среду на селективную; в течение следующих 3 сут ежедневно менять селективную среду, селекцию проводить в присутствии гентамитдана (200 мкг/мл) по крайней мере в течение первых 6 суток.
Селекция
генетически трансформированных клеток
Среда ГАТ. В присутствии ингибитора эндогенного синтеза de novo пурийовых и пиримидиновых нуклеотидов — аминоптерина (аналога фолиевой кислоты) соматические клетки ауксотрофны по гипоксантину и тимидину и их выживаемость зависит от наличия ферментов реутилизации пуриновых и пиримидиновых оснований — ГФРТ и ТК соответственно [3, 41]. ТК“-клетки (устойчивые к БДУ) и ГФРТ "'-клетки (устойчивые к ТГ) трансформируют генами ТК и ГФРТ (КГФРТ) соответственно и генетически трансформированные клетки отбирают на среде ГАТ.
1000-к,ратный раствор аминоптерина (1 мг/мл): 20 мг аминоптерина растворить в 1 мл 2 М раствора NaOH, добавить 18 мл Н20, простерилизовать фильтрованием; хранить при —20 °С. После оттаивания для растворения аминоптерина раствор можно кратковременно нагреть в пламени спиртовки.
100-кратный раствор гипоксантина и тимидина: 150 мг гипоксантина растворить в 2 мл 2 М раствора NaOH, добавить 48 мл Н20, отдельно растворить 50 мг тимидина в 50 мл НгО, растворы слить вместе, простерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °С (по 5 мл).
Для приготовления среды ГАТ к 440 мл ростовой среды добавить
5 мл 100-кратного раствора гипоксантина и тимидина, 0.5 мл 1000-кратного раствора аминоптерина и 50 мл СЭК. При селекции клеток среда ГАТ меняется вначале 1 раз в 3—4 сут.
Среда МК.ГАТ (МКГАС). Микофенольная кислота ингибирует
инозинмонофосфатдегидрогеназу, блокируя тем самым превращение ИМФ в ксантинмонофосфат (КМФ), непосредственный предшественник ГМФ. В этих условиях даже при наличии ГФРТ клетки неспособны при отсутствии в среде гуанина синтезировать ГМФ. КГФРТ Е. coli в отличие от ГФРТ соматических клеток способна узнавать ксантин и превращать его в КМФ; поэтому клетки, экспрессирующие ген КГФРТ, способны выживать на среде, содержащей микофеноль-ную кислоту и ксантин. Добавление ингибиторов биосинтеза нуклеотидов de novo — аминоптерина или азасерина (более специфично ингибирующего биосинтез пуриновых нуклеотидов, но не пиримидиновых) — приводит к более полной остановке роста клеток и более быстрому откреплению не экспрессирующих ген КГФРТ клеток от субстрата [42, 43, 44].
Раствор микофенольной кислоты: 50 мг микофенольной кислоты растворить в 1 мл 2 М раствора NaOH, добавить 24 мл НгО, про- ' стерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °С.
1000-кратный раствор азасерина: 80 мг азасерина растворить в 1 мл 2 М раствора NaOH, добавить 19 мл НгО простерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °С.
500-кратный раствор ксантина: 5 г ксантина растворить в минимальном объеме 30%-ного раствора NaOH при легком нагревании, довести НгО объем до 10 мл, простерилизовать фильтрованием, хранить при комнатной температуре.
Для приготовления среды МКГАТ к 435 мл ростовой среды добавить 5 мл 100-кратного раствора гипоксантина и тимидина, 0.5 мл 1000-кратного раствора аминоптерина, 1‘ мл 500-кратного раствора ксантина, 1—5 мл раствора микофенольной кислоты (в зависимости от линии клеток-реципиентов, так, для клеток китайского хомячка и человека селективной является концентрация микофенольной кислоты 4 мкг/мл, тогда как для клеток зеленой мартышки необходимо добавлять в среду микофенольную кислоту в концентрации не ниже 20 мкг/мл) и 50 мл СЭК. Для доведения pH среды до 7.2—7.4 добавить стерильно 1—3 капли концентрированной НС1.
