Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
224 Часть III. Аналитические методы
белка. Коллоидные растворы часто адсорбируют индикаторы, и для определения pH таких растворов применяют иные методы.
Каждый индикатор в отдельности пригоден для работы только в узком интервале pH. Если же возникает необходимость найти примерное значение pH неизвестного раствора или следить за изменениями pH в широком диапазоне, используют смесь индикаторов. Набор универсальных индикаторов охватывает область pH от 3 до 11. Существуют также индикаторные бумаги; одни из них предназначены для широкого интервала значений pH, другие — для узкого. У индикаторных бумаг те же преимущества и недостатки, что и у растворов индикаторов, например они также непригодны для измерения pH сильно окрашенных растворов, а некоторые из них избирательно адсорбируют из растворов определенные вещества.
Приборы, основывающиеся на применении индикаторов, в настоящее время широко не используются. Одним из таких приборов является, например, компаратор, при помощи которого наблюдатель сравнивает окраску индикатора в исследуемом растворе с набором окрашенных стекол. Сопоставление и оценка проводятся в компараторе визуально; точность метода не превышает 0,1 единицы pH.
Можно пользоваться также «методом клина», при котором раствор неионизованной формы индикатора наливают в один клиновидный отсек кюветы, а ионизованной — в другой. Наблюдатель видит слева окраску, присущую одной из форм индикатора, а справа — другой. Поскольку клинья перекрывают друг друга, окраска в середине является промежуточной между двумя вышеупомянутыми и зависит от толщины клиньев. Значение pH определяют, сопоставляя окраску в разных частях кюветы с окраской неизвестного раствора. В настоящее время все чаще применяют индикаторы’в сочетании со спектрофотометрией.
7.4.3. рН-стат
pH-стат представляет собой разновидность автоматического титратора, который используется для поддержания постоянства pH в ходе реакции, связанной с высвобождением или поглощением протонов. По кривой автоматической регистрации расхода добавляемого реагента во времени можно определить скорость реакции. Необходимым для этого оборудованием являются: стеклянный электрод, рН-метр, самописец, регулятор и бюретка. Можно применять обычные бюретки, снабженные магнитным клапаном, однако лучше для этой цели подходит бюретка-шприц с автоматическим приводом. Регулятор нужен для отключения тока в электрической цепи автоматического привода при достижении конечной точки титрования. В усовершенствованных моделях автоматиче-
Гл. 7. Потенциометрия, электрометрия и полярография 225
Рис. 7.6. Установка для автоматического контроля за pH.
1 — исходный раствор; 2 — реагент; 3 — клапан; 4 — мешалка; 5 — электрод; 6 — раствор с доведенным pH; 7 — усилитель; 8 — регулятор; 9 — к самописцу.
ских титраторов количество добавляемого реагента по мере приближения к конечной точке титрования уменьшается,' что позволяет избежать «перетитровывания» раствора. Стеклянные рН-электроды, используемые в кинетических исследованиях, должны быть очень точными и давать стабильные показания. Реакционный сосуд с раствором, в который погружены стеклянный электрод и каломельный электрод сравнения, необходимо термостатировать.
Применимость данного метода несколько ограничена по ряду причин. Например, раствор в реакционном сосуде необходимо непрерывно перемешивать, а это может вызывать денатурацию белка и дополнительное растворение двуокиси углерода в реакционной смеси. Другие трудности — это существование неизвестного контактного потенциала и подтекание жидкости из кончика бюретки, находящегося под поверхностью раствора. Подтекание можно уменьшить, если плотность жидкости, вытекающей из бюретки, сделать ниже плотности реакционной смеси.
Основное применение pH-статы находят в области ферментативной кинетики, особенно при изучении протеолитических ферментов. С помощью pH-статов изучают процессы гидролиза пептидов и нуклеиновых кислот. Их можно использовать в бактериологических исследованиях и на производстве. На рис. 7.6 схематически представлена установка, применяющаяся в производственных масштабах.
226 Часть III. Аналитические методы
7.4.4. Чувствительные рН-метры
для кинетических исследований
Основная трудность, возникающая при работе с рН-статом, связана с необходимостью интенсивного перемешивания раствора, которое может денатурировать белок. Кроме того, у системы существует постоянная времени, и для некоторых кинетических экспериментов она может оказаться слишком большой. По этой причине для точной регистрации небольших изменений pH применяют чувствительные рН-метры. При этом отпадает необходимость и в титровании кислотой или щелочью, и в перемешивании в ходе реакции. Вмонтированную в прибор магнитную мешалку можно выключить в ходе эксперимента. Изменение pH за все время проведения опыта настолько незначительно, что не сказывается на скорости реакции. В сущности шкала pH при этом утрачивает свое значение, и прибор должен'быть проградуирован в мВ. Чувствительность метода зависит от постоянной времени усилителя и самописца, а также от буферной емкости образца и среды. При достаточно низкой концентрации буфера некоторые приборы способны зарегистрировать сдвиг на всю шкалу при появлении всего лишь 0,1 мкмоля ионов водорода. При использовании чувствительных рН-метров можно измерять значения начальной скорости реакции с точностью до нескольких секунд.
