Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
........ »
Расстояние, пройденное глюкозой т. е. все величины определяются по отношению к глюкозе.
Гл. 3. Хроматографические методы 75
Рис. 3.4-. Восходящая (а) и нисходящая (б) хроматография на бумаге.
1 — крышка; 2 — держатель; 3 — зажим; 4 — бумага; 5 — стеклянная камера; 6 — место нанесения пробы; 7 — растворитель; 8 — стеклянная палочка; 9 — лоток с растворителем.
Хроматогр а ф и рование на бумаге . проводят восходящим и нисходящим способами (рис. 3.4). И в том, и а 6
в другом случае растворитель наливают на дно герметичной камеры или стеклянного резервуара для насыщения атмосферы парами растворителя, и лишь затем помещают в камеру бумагу. При восходящей хроматографии бумажную полосу либо погружают в растворитель вертикально, например, свернув ее трубкой, либо подвешивают таким образом, чтобы нижний конец полосы бумаги был погружен в растворитель. Места нанесения пробы должны находиться на определенном расстоянии от поверхности растворителя; по мере движения растворителя под действием капиллярных сил вертикально вверх происходит разделение веществ. При нисходящей хроматографии верхний конец бумажной полосы с образцом, нанесенным недалеко от кромки бумаги, закрепляют в лотке, находящемся в верхней части камеры, а нижний конец бумаги спускают вниз так, чтобы он не соприкасался с налитым на дно камеры растворителем. Перед началом хроматографирования лоток заполняют растворителем. Под действием капиллярных сил и силы тяжести растворитель начинает двигаться вниз по бумажной полосе, в ходе чего и происходит разделение. Из-за простоты первый вид хроматографии применяется чаще, однако скорость движения растворителя при нисходящей хроматографии гораздо выше, чем при восходящей.
Хроматографию на бумаге, так же как и ТСХ, можно проводить двухмерным способом (разд. 3.2.3). Существуют различные типы бумаги, различающиеся по своим характеристикам — так называемые медленная, средняя, быстрая. Для удаления загрязнений, затрудняющих в ряде случаев дальнейший анализ, некоторые виды хроматографической бумаги обрабатывают кислотой. Марки бумаги различаются также и по степени поглощения сухими волокнами воды, содержание которой колеблется от 115 до 195%. Одномерные хроматограммы всегда следует разгонять по ходу волокон, в соответствии с рекомендациями, указанными на упаковке. В табл. 3.4 приведены некоторые системы растворителей, обычно использую-
76 Часть II. Методы разделения
щиеся для разделения ряда биологических соединений методс'м обычной распределительной хроматографии на бумаге.
Таблица 3.4
Некоторые системы растворителей, применяющихся в хроматографии на бумаге
Соединения Система растворителей, объец/объеИ
Аминокислоты н-Бутанол/уксусная кислота/вода (40/10/50)
Моно- и дисахариды «-Бутанол/пиридин/вода (33/33/33)
Хлорофиллы. и каротиноиды Метанол/пиридин/вода (25/12/63)
к-Бутанол/пиридин/вода (50/28/22)
1-пропанол/петролейный эфир (4/96)
Хлороформ/петролейный эфир (30/70)
Для определения местоположения соединений хроматограммы просматривают в ультрафиолетовом свете или опрыскивают специальными растворами. Опрыскивать хроматограммы 50 %-ной серной кислотой не рекомендуется, поскольку при этом разрушается бумага. Использование бумажной хроматографии в препаративных целях весьма ограничено; в тех случаях, когда такое разделение все же производится, участки хроматограммы, содержащие интересующее вещество, вырезают, а затем элюируют материал с помощью соответствующих растворителей.
Как правило, при бумажной хроматографии неподвижная фаза является водной, а в качестве подвижной применяются органические растворители. Однако некоторые соединения лучше разделяются в тех случаях, когда неподвижная фаза представляет собой органический растворитель, а подвижная — воду. Хроматографическую бумагу предварительно пропитывают органическим соединением, чаще всего жидким парафином. Для этого ее погружают в раствор жидкого парафина в петролейном эфире, а затем высушивают; эфир испаряется, а бумага пропитывается парафином. После нанесения на бумагу образца пронодят обычное хроматографирование с помощью водного растворителя. Этот метод применяется также и при разделении соединений методом ТСХ; он называется хроматографией с обращенной фазой.
3.3.2. Распределительная хроматография на колонке
В данном виде хроматографии в качестве носителя обычно применяют целлюлозу, крахмал, кремниевую кислоту или какие-либо другие соединения; неподвижная фаза, как правило, является водной. Чтобы разделение было успешным, носитель должен содержать определенное количество воды, некоторые из них — до 50% (вес/объем). Гидратированный носитель смешивают с соответствую-
Гл. 3. Хроматографические методы 77
щим несмешивающимся растворителем до. образования суспензии. Суспензию помещают в стеклянную трубку,' как и при обычной колоночной хроматографии (разд. 3.10.2). Разделяемую смесь наносят сверху и проводят хроматографирование. Вещества с разными эффективными коэффициентами распределения движутся по колонке с разными скоростями и поэтому элюируются в разное время. Следует иметь в виду, что при распределительной хроматографии на колонке может играть роль и адсорбция.
