Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
взаимодействий между белком и носителем. Ковалентные связи
протеолитических ферментов с носителем в большинстве случаев существенно
повышают их стабильность, потому что .предотвращают взаимодействие между
индивидуальными молекулами, и, следовательно, автолиз.
12.3.1. Устойчивость при хранении
В обзоре Гольдмана и др. [15] описан ряд ферментов, которые не теряли
свою активность при хранении при 4 °С в течение нескольких месяцев,
будучи связанными с сополимером этилена и малеинового ангидрида или с КМ-
целлюлозой или сефарозой. Лиофильно высушенные препараты этих
иммобилизованных ферментов сохраняли свою активность при продолжительном
хранении не только при 4 °С, но также и при комнатной температуре.
Ферменты, связанные с п-аминобензилцеллюлозой, сополимером лейцина и л-
ам'инофенилаланином или производным крахмала-диаль-дегид-крахмал-
метилендианилином (разд. 8.2.2), могут также сохраняться на холоду в
течение нескольких месяцев. Однако они почти полностью инактивируются при
лиофилизацни или высушивании на воздухе, возможно из-за гидрофобной
природы носителя. Ферменты, присоединенные к сополимеру метакриловой
кислоты и фторанилида метакриловой кислоты, обычно теряют свою активность
при хранении в течение нескольких недель при 4°С.
Гольдштейн [16] исследовал стабильность нескольких иммобилизованных
протеиназ. Водные суспензии анионных производных ЭМА-МДА (см. разд. 12.2)
химотрипсина, субтилизина Карлсберга и субтилизина Ново незначительно
теряют свою активность при хранении при 4°С в течение 3-4 месяцев.
Суспензии ЭМА- МДА производных папаина и трипсина могут сохраняться в
этих условиях до 8 месяцев без потери активности. Соответствующие ка-
Таблица 12.5
Сохранение ферментативной активности при лиофилнэаини (в %)
Фермент ЭМА- -МДА ЭМА-гидразидные производные
анканиоо катионное анионное катионное
Трипсин 76 46 100 93
Химотрипсин 30 8 50 91
Субтилизин Ново 60 5 70 98
Субтилизин Карлсберга 27 22 70 86
Иммобилизованные ферменты
433
тионные производные ЭМА-МДА теряют 20-30% своей актив--ности в идентичных
условиях хранения. ЭМА-гидразидные производные, как анионные, так и
катионные, всех этих пяти ферментов показывают высокую устойчивость при
хранении. Даже после 1 года хранения при 4°С в присутствии бактерицидных
агентов суспензия не теряла свою активность.
Сохранение ферментативной активности различных ЭМА-МДА и ЭМА-гидразидных
производных после их лиофилизации показано в табл. 12.5. При хранении
лиофилизованных порошков иммобилизованных ферментов при 25 °С в течение 1
года в эксикаторе не наблюдалось никакого изменения активности.
12.3.2. Зависимость устойчивости от pH
Влияние pH на устойчивость анионных и катионных ЭМА-гидразидных
производных химотрипсина, трипсина и субтилизина Ново при инкубации при
37 °С в течение 30 мин показано на рис. 12.5. По сравнению с
соответствующими нативными ферментами все анионные ЭМА-гидразидные, так
же как и не показанные на рисунке анионные ЭМА-МДА-производные,
демонстрируют повышенную устойчивость при щелочных pH. Повышение
устойчивости в кислой области наблюдалось для катионных ЭМА-гидразидных и
ЭМА-МДА-производных. Изменение картин для зависимостей устойчивости от pH
может быть объяснено влиянием локального pH, создаваемого в результате
перераспределения водородных и гидроксильных ионов вблизи
иммобилизованных полиэлектролит-ных производных фермента.
12.3.3. Термическая устойчивость
Термостабильность анионных и катионных ЭМА-МДА- и ЭМА-гидразидных
производных показана на рис. 12.6. Все анионные ЭМА-гидразидные
производные более устойчивы, чем соответствующие нативные ферменты.
Анионные ЭМА-МДА-производные всегда менее устойчивы, чем соответствующие
ЭМА-гидразидные производные. Во всех случаях было обнаружено уменьшение
термостабильности катионных производных в противоположность анионным
аналогам. Катионные ЭМА-МДА-производные менее термостабильны, чем
нативные ферменты. Эти результаты согласуются с общим представлением о
влиянии химической природы различных нерастворимых носителей. ЭМА-МДА-
смолы содержат объемные ароматические группы (разд. 12.2), и поэтому они
более гидрофобны, чем соответствующие ЭМА-гидразидные смолы. Тем самым
экспериментально доказано, что термостабильность и устойчивость к
лиофилизации для многих иммобилизованных ферментов качественно зависят от
химической природы нерастворимого носи-
434
Глава 12
Рис. 12.5. Влияние pH на стабильность анионных и катионных ЭМА-гидразнд-
производных химотрипсина (а), трипсина (б) и субтилизина Ново (в) [16]. t
- нативный фермент; 2 - анионное производное ЭМА-гидразида; 3 - катионное
производное ЭМА-гидразида. Испытуемые растворы <0,5 мл) в подходящем
буфере, содержащие фермент илн иммобилизованное производное фермента
(около 15 эстеразных единиц в 1 мл), инкубировали при 37 "С в течение 30
мин; отбирали аликвоты по 0,1 мл и определяли в иих стандартным методом
остаточную эстеразную активность. Использовали следующие буферные
