Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
активности в зависимости от заряда носителя рассчитан также и
теоретически по уравнению
ДрН=рН'-рН°=0,43,геф/?7\ (12.1)
где ДрН - разность между локальным pH в фазе полиэлектролит- фермент
(pH1) и pH внешнего раствора (pH0), ф -электролитический потенциал вблизи
частицы заряженного иммобилизованного фермента, е - заряд на протоне, г -
валентность (для ионов водорода равна 1), k - константа Больцмана, а Т -
абсолютная температура. Теоретические расчеты на основе этого уравнения
хорошо согласуются с экспериментальными результатами. Описанные феномены
относятся к эффектам, индуцируемым заря-
Иммобилизованные ферменты
427
женньгм носителем. Они ведут к неравномерному распределению водородных и
гидроксильных ионов между полиэлектролитной "фазой иммобилизованного
фермента" и внешним раствором, вызывая более .низкий "локальный pH"
вблизи анионного производного фермента и более высокий "локальный pH" в
микроокружении катионного производного фермента ,[16].
Из уравнения (12.1) следует, что присоединение фермента к нейтральному
носителю не должно приводить к сдвигу pH. Дей-
Рис. 12.2. Температурные зависимости гидролиза казеина свободным и
связанным трипсином (быка) [5].
Реакционные смесн содержали 10 мкг свобод* ного или 100 мкг связанного на
носителе трип* окна в 1,6 мл фосфатного буфера (pH 7,5).
/ - свободный трипсин; 2 - трипсин, связан* вый с КМ-целлюлозой; 3 -
трипсин связан ныв с малеиновым сополимером.
-I_____I---:-----LJ
Ю 40 so во Температура,аС
ствительно, кривые зависимости протеолитической активности химотрипсина
от pH и для свободного фермента, и для связанного с
оксиалкилметакрилатным гелем, например, имеют одинаковые оптимумы [51].
Однако это не так в отношении эстеразной активности этого же фермента.
Если в качестве субстрата использовать этиловый эфир ацетилтирозина,
наблюдается сдвиг оптимума pH в направлении более высоких значений (в
щелочную область) даже с химотрипснном, связанным с этим нейтральным
носителем. Такие же результаты получены Аксеном и Эрнбеком [1],
исследовавшими химотрипсин, связанный с сефадексом и сефарозой. Показано,
что сдвиг оптимума pH в этом случае только кажущийся и обусловлен
накоплением продукта расщепления - ацетилтирозина вблизи поверхности
геля, вследствие чего и наблюдаются различия в значениях pH вблизи
поверхности геля и окружающего раствора. Следовательно, сдвиг оптимума pH
только кажущийся; это подтверждено с помощью внутреннего индикатора,
причем сдвиг зависит, очевидно, от количества связанного фермента.
Конецный и Сланицка [30, 31], кроме того, показали, что в отличие от
свободного фермента активность иммобилизованного зависит также от
концентрации буфера, а кривая зависимости активности от pH для
иммобилизованного фермента при данной кон-
428
Глава 12
центрации буфера в значительной мере зависит от рК буфера. На рис. 12.4
показана зависимость активности эстеразы из Bacillus subtilis,
присоединенной с помощью глутарового альдегида к ал-киламину на пористом
стекле CPG-550, покрытом двуокисью циркония, от pH различных буферных
систем, а для фосфатного буфера
Рис. 12.3. Зависимость от pH при низкой ионной силе (Г/2=0,001)
активности химотрипсина (/), полианион-ного производного химотрипсина на
сополимере этилена с малеиновой кислотой (2) и поликатнонного
производного химотрипсина с поли-L-орнитином (3), определенной по
гидролизу этилового эфира iN-ацетил-Ь-тнрозина [17].
1 S 8 Ю
pH
также и от концентрации этого буфера. Полученные результаты детально
обсуждены с привлечением уравнений Энгассера и Хорвата [11]; выведены
простые уравнения для внутреннего pH (или внутреннего градиента pH).
Изменения внутреннего pH, как правило, зависят от внешнего pH,
концентрации буфера и его р/С; последний фактор весьма сильно влияет на
определяемые значения
-Ктп{ каж).
Для того чтобы отличить влияние химической природы носителя и
пространственные и диффузионные эффекты, Свенсон [48] приготовил
одинаковые растворимые и нерастворимые производные субтилизина, связывая
фермент с бромцианактивированным ДЭАЭ-декстраном и ДЭАЭ-сефадексом. Как
видно из данных, приведенных в табл. 12.3, ДЭАЭ-декстран-субтилизин имеет
тот же оптимум pH и Кт для гидролиза эфира, что и субтилизин. Напротив,
кривая pH-зависимости, полученная для ДЭАЭ-сефа-декс-субтилизина
обнаруживает сдвиг в щелочную область pH и возрастание Ат{каж>. В табл.
12.3 приведены также константы скорости kKiT уменьшающиеся при
модификации фермента. Модификация, но в значительно большей степени
иммобилизация приводят к значительному снижению активности субтилизина по
Иммобилизованные ферменты
42"
высокомолекулярному субстрату-казеину. В то время как активность
свободного субтилизина >400 мкмоль освобождающегося Н+ в минуту на 1
мкмоль фермента, после присоединения субти-
рн
Рис. 12.4. Зависимость от pH активности связанной со стеклом эстеразы из
Bacillus subtilis в 10 мМ фосфате (/), трис (2), борате (5) и 2 мМ
