Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
сорбируется только 0,10 мкмоль. Сорбционная емкость последнего сорбента
относительно плазми-ноген В-сефарозы составляет ~35%.
Для того чтобы установить, какая часть активационного пептида
ответственна за специфическое взаимодействие, Уаймен и Уоллен [1290]
нанесли триптический гидролизат 1 мкмоль активационного пептида на
колонку с плазминоген В-сефарозой. Из пяти пептидов, образующихся после
гидролиза трипсином, сорбируется только гептапептид Ala-Phe-Glu-Tyr-His-
Ser-Lys, который занимает 41-51-положение 81-членного Ыжонцевого пептида.
Следовательно, данный пептид ответствен за взаимодействие, которое, но-
видимому, имеет важное значение для конформационного состояния молекулы
плазминогена.
11.7. ИММУНОАНАЛИЗ
Чрезвычайно чувствительный и избирательный иммуноанализ используется при
определении концентраций молекул, к которым могут быть получены антитела.
Иммобилизация исследуемого вещества или антитела приводит к значительному
упрощению иммуноанализа (радиоиммуноанализ, ферментативный иммуноанализ и
метод флуоресцентных антител).
11.7.1. Твердофазный радиоиммуноанализ
Классический иммуноанализ, описанный Ялоу и Берсоном [1299], основан на
способности немеченного антигена конкурировать с антигеном, меченным
радиоактивным изотопом, при сорбции на связывающих центрах антитела,
число которых ограниченно.
Примеры применения аффинной хроматографии
381
Следовательно, процесс состоит в ингибировании связывания чистого
меченого антигена антителом под влиянием немеченого антигена, содержание
которого и определяется. Если система находится в равновесии,
радиоактивность, связанная с антителами, отделяется от несвязанной
радиоактивности, а затем измеряется одна из них. По этим данным можно
рассчитать содержание немеченого антигена в неизвестном образце. Предел
обнаружения в методе радиоиммуноанализа 10""-10~17 моль, т. е. метод
позволяет количественно определять большинство биологически активных
соединений, которые находятся в биологических системах в нанограммовых и
пикограммовых количествах. Метод существенно упрощен благодаря
использованию связывания антител на нерастворимых носителях [178, 1272].
Антисыворотки, ковалентно связанные с агарозой, целлюлозой и сефадексом,
в системах радиоиммуноанализа белков и гаптенов исследовались Болтоном и
Хантером [135]. Показано, что ковалентное связывание с нерастворимой
матрицей .не оказывает неблагоприятного влияния на антисыворотку.
Ухудшение чувствительности анализа обусловлено в большинстве случаев
пространственными затруднениями для высокомолекулярных антигенов.
Богданов и Страш [131] указали на возможные ошибки радиоиммуноанализа,
возникающие из-за большого объема атома радиоактивного иода.
Радиоиммуноанализ становится широко распространенным методом, особенно
для наркотиков, гормонов, химиотерапевтических средств, антибиотиков,
иммуноглобулина и т. п., как это показано в обзорных статьях и книгах [3,
154, 214, 460, 679].
Примером применения твердофазного радиоиммуноанализа является определение
орнитинтранскарбамилазы, синтезируемой в системе транскрипции -
трансляции, управляемой геном argF, вводимым специализированным
трансдуцирующим бактериофагом [336].
Антиорнитинтранскарбамилазные антитела, связанные ковалентно с сефарозой
4В (0,1 мл), добавляют к испытуемому раствору (общий объем 0,5 мл),
концентрация фосфата в котором 0,05 моль/л, хлорида натрия 0,15 моль/л,
pH 7,2. Иопытуемую смесь перемешивают непрерывно с помощью роторной
мешалки со скоростью 5 об/мин в термостате при 33 °С в течение 60 мни,
разбавляют 5 мл того же буфера и центрифугируют при 5<00 g в течение 3
мин; супернатант отбрасывают. Сефароэу переносят на фильтр ватман CF/C
диаметром 25 мм и промывают 50 мл того же буфера. Измеряют
радиоактивность на сцин-тилляинонном счетчике Beckman LS 230 с жидким
сцинтиллятором Beckman Ready-Solv VI.
Описанный метод - быстрый, чувствительный и специфичный к
орнитинтранскарбамилазе; он может быть полезен в работах, посвященных
выяснению механизма контроля синтеза аргинина, проводимых in vitro.
382
Глава It
11.7.2. Анализ на иммуносорбенте со связанным ферментом (ЭЛИСА)*
Ингвал и др. [324] применили принцип радиоиммуноанализа, описанный для
определения кроличьего иммуноглобулина G; однако вместо меченных
радиоактивным изотопом антигенов они конъюгировали последние с ферментом
- щелочной фосфатазой. Основой конкурентного иммуноанализа является
разделение свободных и связанных с антителами антигенов, так чтобы
антигены можно было определить количественно. Это разделение можно
облегчить фиксацией антител на твердой фазе путем физической сорбции на
стенках полистирольных пробирок.
Иммуноанализ проводят следующим образом. Полистирольные пробирки (80ХП
мм) покрываются антителами при обработке 1 мл раствора антител. Растворы
антител разбавляют 0,1 М Na карбонатного буфера (pH 9,8) или фосфатным
(солевым) буфером. Пробирки с этими растворами оставляют на 3 ч при 37
