Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
этого сродства от pH, но также и концентрацией иммобилизованного лиганда
[40]. Нейтральная протеаза является металлоферментом и поэтому
ингибируется 1,10-фенантролином и
0,8
оа
2,0
1,8
<Л
0.8
оа
ta
0,8
ОА
%
i
%
I
<Г
В
1
г"
I
у
*
а
I
1
I
Объем элюирования, мл
Рис. 10,3, Увеличение задержки L-гистидинолфосфатаминотрансферазы при
увеличении концентрации фосфатцитратного буфера. Буферы содержали ЫагНР04
(в указанных концентрациях) и были доведены до pH 6.0 лимонной кислотой
[35].
ЭДТА. Присутствие этих хелатирующих агентов в концентрации 1-5 мМ
предотвращает сорбцию фермента на упомянутых специфических сорбентах.
Влияние pH на аффинную хроматографию обсуждалось в разд. 5.6.
Следует помнить, что для сорбции данного фермента оптимальное значение pH
не обязательно совпадает с оптимальным
262
Глава 10
значением pH для катализа. Касаи и Ишии [22] нашли, что для сорбции
трипсина .на сефарозе с присоединенным глицилглицилар-гинином оптимальным
является pH 5,6, однако это значение не является оптимальным для
катализа. Следовательно, полезно определить оптимальные условия
образования каждого индивидуального комплекса выделяемого вещества с
иммобилизованным аффинным лигандом. Эти условия удобнее всего находить по
результатам статической (одноразовой) сорбции (см. рис. 3.!, на котором
показана сорбция химотрипсина на карбобензоксиглицил-D-фенилаланил-iNHa-
сфероне в зависимости от pH и ионной силы раствора) [38J, Из рис. 3.1
следует, что повышение ионной силы буфера приводит к снижению количества
сорбированного химотрипсина, Напротив, найдено, что активный папаин не
связывается на сефарозе с присоединенным глицилглицил-О-бензилтирозилар-
гинином при низкой концентрации солей [5]. На рис. 10.3 показана задержка
выхода L-гистидинолфосфатаминотрансферазьг при хроматографии на агарозе с
присоединенным гистидинолфосфатом, возрастающая с увеличением
концентрации фосфат-цитратного буфера [35]. Такое возрастание задержки
выхода нельзя, однако, объяснить увеличением ионной силы, поскольку
положение пика фермента не меняется, если ионную силу 0,05 М фосфатного
буфера увеличить, добавляя раствор 0,9 М хлорида натрия. Задержка выхода
фермента имеет место не только в фосфатно-цитратном буфере, но также в
сульфатном или фосфатном; однако степень задержки выхода, конечно,
различна. Для ряда карбоновых кислот, используемых при доведении 0,5 М
гидрофосфата натрия до pH 6,0, найдено, что задержка выхода фермента
возрастает с увеличением основности кислот в такой последовательности;
ацетаК <сукцинат<цитрат. Ребо и др. [33] отмечают, что наиболее важными
факторами, влияющими на адсорбцию белков на алкил- сефарозе, являются
наряду с длиной алифатической цепи концентрация и природа присутствующих
в среде солей. Важная роль солей в гидрофобной хроматографии детально
рассмотрена в разд.
7.1, Влияние индивидуальных ионов на гидрофобные взаимодействия может
быть выражено следующей схемой (из рекомендаций фирмы Pharmacia):
Увеличение высаливающего действия
Анионы: POJ", S02-, СНаСОО", Cl", Вг", N03, Cl04, I-, SCN",
Катионы: NH}, Rb+, К+. Na+, Cs+, Li+, Mg!+, Caa+, Baa+.
Увеличение хаотропного действия
При постоянной ионной силе действие ионов на адсорбцию сильно зависит от
природы ионов: некоторые из них ее уменьшают, другие увеличивают, и это
скорее связано с лиотропным, чем с электро-
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
263
Таблица 10.1
Влияние ионной силы буферного раствора иа сорбцию |Л-галактозидазы
на колонке агарозы с присоединенным п-аминофенил-р-о-
тиогалактопиранозндом (колонка 114 X 17 мм, скорость потока 2,0 мл-мни^-
см'*)
Ионная сила Связанней белок, мг Связанная активность, ед. Удельная
активность, еД./мг
0,010 75 6000 60
0,020 32 5500 190
0,035 14 3600 320
0,050 1,2 350 340
статическим действием. Анионы по уменьшению влияния на адсорбцию
располагаются в ряд: тиоцианат=иодид>хлорид;>аае-тат>цитрат, который
совпадает с рядом Гофмейстера для нейтральных солей [14].
Если ионная сила исходного буфера не мешает образованию аффинного
комплекса, этот буфер выгодно использовать, потому что он уменьшает
неспецифическую адсорбцию полиэлектролитов на заряженных группах
присоединенного аффинного лиганда, возникновение которых вполне вероятно.
Поэтому к буферному раствору, из которого проводят сорбцию, рекомендуется
добавлять ~0,5 молЬ/л хлорида натрия. Влияние ионной силы на связывание
ji-галактозидазы на сефарозе с присоединенным п-аминофенил-р-D-
тиогалактопиранозидом показано в табл. 10.1. С увеличением ионной силы
количество сорбированного фермента уменьшается, но его удельная
активность, напротив, растет [34].
Необходимость введения в раствор, из которого производится сорбция, ионов
металлов или использования других специфичес-
Таблица 10.2
Влияние и АТР на сорбцию АТРаэы сефарозой с присоединенным ингибитором
АТРазы* [37]
Добавки Нанесение АТРаэы, нмоль/мин Элюирование связанной АТРазы,
