Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
обеспечить достаточную емкость и одновременно позволить освобождаться
выделяемому веществу из специфического комплекса с иммобилизованным
аффинантом в достаточно мягких условиях, не приводя, однако, к
неспецифической сорбции. Свойства пространственной группы, вводимой между
аффинным лигандом и поверхностью нерастворимой матрицы [6], могут
оказывать влияние на свойства сорбента, как и концентрация аффинного
лиганда. Специфический сорбент должен быть приготовлен таким способом,
чтобы все группы, способные к присоединению, были блокированы (разд. 8.4)
и чтобы число групп, способных принимать участие в неспецифической
сорбции, было минимальным (разд. 10.3). Однако особенно важно, чтобы все
молекулы аффинного лиганда, которые не присоединились к носителю
ковалентной связью, были тщательно отмыты (разд. 8.6),
Поскольку ионные и водородные связи, гидрофобные взаимодействия и силы
Ван-дер-Ваальса - Лондона могут в различной степени участвовать в
связывании комплементарных участков аффинного лиганда и выделяемых
веществ, в каждом случае долж-
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
259
ны быть свои оптимальные условия для сорбции и десорбции. Как правило,
исходные условия для сорбции должны быть выбраны таким образом, чтобы они
обеспечивали максимальное связывание выделяемого вещества. Выбор
исходного буфера в основном определяется оптимальными условиями
комплексообразования аффинного лиганда с выделяемыми веществами, а также
температурой, pH и ионной силой; кроме того, этот выбор зависит также от
содержания ионов металлов и других специфических факторов,
10.1.1. Влияние температуры, pH и солей
Влияние температуры в аффинной хроматографии обсуждалось в разд. 5.5. На
рис. 10.1 приведен практический пример, показывающий уменьшение с
повышением температуры сорбции смеси нук-леаз на сефарозе 4В с
присоединенным 3'-(4'-аминофенилфосфо-рил)дезокситимидин-5'-фосфатом [2].
Практическое использование pH при сорбции нейтральной про-теазы из
Bacillus subtilis на сефарозе с присоединенным глицил-D-
10 го зо ю го зо Объем элюирования, мл (r)
Рис. 10.1. Аффинная хроматография смеси, содержащей нуклеазу-Т- (6-48),
нук-
леазу-(49, 50-126) и нуклеазу-(99-149) в присутствии Саг+ при различных
температурах на сефарозе 4В, замещенной 3'-(4'-
амннофенилфосфорил)дезокснтими-дин-5'-фосфатом (сефароза-pdTp) [2].
Смесь, содержащую 0.D85 мкмоль нуклеазы*Т-(6-48), 0*060 мкмоль нуклеазы-
(49, 60*126)* 0,067 мкмоль пуклеаэы-(99-Н9) и 0,01 М хлорид кальция в 0,2
мл 0,1 М раствора ацетата аммония (pH 8), уравновешивали при данной
температуре и наносили на колонку (40X10 мм) с рубашкой с сефарозой-pdTp.
Элюирование проводили раствором: 0,1 .4 ацетат аммония + -§-0.01 М хлорид
кальция (pH 8). Стрелками указаны моменты, в которые начиналось
элюирование 0,1 л. уксусной кислотой. Относительную интенсивность трип-
гофановой флуоресценции so фракций* определяли для регистрации нуклеазы-
(9СИ49), имеющей единственный трнп-тофановый остаток. / - оптическая,
плотность при 280 нм; 2 - относительная интенсивность
флуоресценции.
17*
260
Глава 10
фенилаланином (через пространственную группу в 23 атома, образуемую
комбинацией триэтнлентетрамина, янтарной кислоты и эти-лендиамина)
показано на рис. 10.2. Максимальная сорбция нейтральной протеазы имеет
место при pH, соответствующих мини-
Рис. 10.2. Влияние pH на адсорбцию нейтральной лротеазы на сефарозе 4В,
замещенной триэтилентетрамином, янтарным антидрндом, триэтилентетрамином
и хлорацетил-Ь-фенилала-нином [401.
Неочищенный фермент (10 мл) растворяли в 0,1 мл уравновешивающего буфера
н наносили на аффинную колонку (220X6 мм), уравновешенную 100 мМ.
хлоридом натрия, 10 мМ хлоридом кальция, содержащим 5 мМ трнс (pH 7,6 или
7,0) или 5 мМ
2-(N морфолино)этаисульфокислоту (pH 6,5 или 6,0). После элюирования в
течение 1 ч при 25 мл/ч каждая колонка промывалась 100 мМ хлоридом
натрия, 10 мМ хлоридом кальция, 50 мМ трис (pH 9,0). как указано
стрелками. Нейтральная протеиназа и суб-тклиэкн идентифицированы по
каталитической активности в отношении гидролиза
3- (2'фурйлакрилоил) глииил-Ь-лейцинамида (ФАГЛА) и этилового эфира N
ацетил L-тирозина (ЭЭАТ). / - оптическая плот^ ность при 280 им; 2 -
относительная активность по ЭЭАТ; 3 - относительная активность по ФАГЛА,
мальным Кт. Нейтральная протеаза эффективно адсорбируется в интервале pH
5-6,5 и таким образом отделяется как от субтили-зина, так и от других
белков, присутствующих в фильтрате культуры. При более высоких pH
нейтральная протеаза не может быть эффективно отделена от субтилизина. Из
комплекса с иммобилизованным аффинным лигандом нейтральную протеазу
освобождают, повышая pH, до значений, при которых связывание субстрата
уже ослабевает, но денатурация фермента еще не происходит. Оптимальное
значение pH для элюирования нейтральной протеазы
Общие вопросы сорбции, элюирования и связывания
261
определяется не только ее сродством к аффинному лиганду и зависимостью
