Структура и функции биологических мембран - Трошин А.С.
Скачать (прямая ссылка):
Обработка хлоропластов 0,3%-ным тритоном Х-100 сопровождалась хотя и меньшими, но все же значительными нарушениями структуры фотосинтетических мембран. Анализ полученных по I схеме тяжелых фрак-
130 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
ций показал, что они состоят из спаренных и отдельных тилакоидов гран и крупных фрагментов мембран. Частицы сопрягающего фактора, по-видимому, разрушаются, так как их не удается наблюдать ни на поверхности тилакоидов, ни в легкой фракции. Мембрана тилакоида подвергается существенному изменению, которое напоминает эрозию (рис. 49). Отверстия, образующиеся в мембране при извлечении субчастиц (молекул белка или, возможно, более сложных структурных компонентов), заполняются фосфорно-вольфрамовой кислотой, электронная плотность которой значительно выше, чем у субчастиц. Размеры фрагментов, составляющих
Рис. 49. Тилакоид граны, выделенный при добавлении в среду дезинтеграции тритона Х-100
Видна «эрозия» мембраны (ув. 154 ООО) t ^
Рис. 50. Фрагменты Ф145, полученные при дезинтеграции хлоропластов 0,3%-ным дигитонином и фракционированные по схеме I (ув. 116 ООО)
Jfj
- V
Л*'»'
.* '* *71 ***•
фракцию Ф145, могут колебаться от нескольких тысяч А до 200—300 А. Структурные нарушения мембран сопровождаются существенными функциональными изменениями — резким ингибированием фотовосстановления НАДФ и феррицианида.
Ниже показано фотовосстановление НАДФ (в мкМ/мг хлорофилла за 15 мин.) хлоропластами и их фрагментами, полученными при обработке 0,3%-ным дигитонином и тритоном Х-100, в присутствии системы аскор-бат-2,6-дихлорфенолиндофенол
Фракции Тритон Х-100 Дигитонин Фракции Тритон Х-1С0 Дигитони
Хлородласты 5,05 8,56 Ф100 0,06 0,16 я
Ф1,3 0,16 0.03 Ф145 0,12 1.29
Ф20 0,09 0,04
Данные по фотовосстановлению феррицианида (в мкМ/г хлорофилла за 5 мин.) хлоропластами и их фрагментами, полученными при обработке 0,3 %-дигитонином и тритоном Х-100, были следующими:
Фракции Тритон Х-100 Дигитонин Фракции Тритон Х-100 Дигитонин
Хлоропласты 9,98 10,4 Ф100 0,48 8,2
Ф!,3 1,36 5,4 Ф145 0,16 1,3
Ф20 1,01 10,2
;>
ГЛАВА 8. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ МЕМБРАН 131
Известно; что тритон Х-100 обладает большим ингибирующим действием на систему фотохимического образования АТФ по сравнению с дигитонином. Фотофосфорилирование прекращается при 0,007%-ной концентрации тритона Х-100, а реакция Хилла в значительной степени ингибируется 0,01%-ным раствором (Vernon et al., 1967).
Учитывая, что тритон Х-100 имеет низкий молекулярный вес и значительно меньшую,чем у дигитонина, неполярную часть молекулы, можно полагать, что он глубже проникает в мембрану и обладает способностью связывать вещества липидного характера, причем образующиеся комплексы имеют сравнительно низкий молекулярный вес и увлекаются в надосадоч-
ную жидкость. Следствием этого является нарушение общей структуры мембран; в местах лизиса их липидного слоя происходит выпадение белковых субчастиц и образование «эрозийных» пятен, заполняемых ФВК. При этом в надосадочную жидкость направляются хлорофилл-белок-липидные комплексы. Частичное извлечение субчастиц, из которых состоят мембраны, сопровождается убыванием активности по тестам на I и II фотохимические системы во фракциях крупных и мелких фрагментов. Указанным структурным и фотохимическим изменениям соответствует характерное изменение строения спектра низкотемпературной флуоресценции (Островская, Кочубей, Рейнгард, 1969). Использование тритона Х-100 в качестве дезинтегрирующего средства не позволило достаточно четко разделить фотосистемы. Эти исследования продемонстрировали относительную «агрессивность» тритона Х-100, в результате чего была сделана попытка разделить фотосистемы, используя в качестве дезинтегрирующего средства дигитонин.
Результаты исследования фотохимической активности получаемых по I схеме фракций (см. выше) указывают на лучшую сохранность фотохимической активности этих фрагментов по сравнению с фрагментами, полученными после фрагментации хлоропластов тритоном Х-100. Снижение
9*
132 СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
активности фотовосстановления феррицианида с переходом от тяжелых фрагментов к легким и вместе с тем фотовосстановление НАДФ в присутствии электрон-донорной системы (аскорбат-2,6-дихлорфенолиндофенол) фракциями легких фрагментов свидетельствуют о частичном разделении первой и второй фотохимических систем под действием дигитонина. Из данных анализа указанных фракций с помощью метода негативного контрастирования видно, что применяемая в этих экспериментах первая схема фракционирования пе давала четкого разделения фрагментов по размерам (рис. 50).
Если способность фрагментов хлоропластов к реакциям фотовосстановления изучалась многими исследователями, то этого нельзя сказать о реакциях фотофосфорилирования. Впервые циклическое фотофосфорили-рование с ФМС фрагментов хлоропластов, полученных обработкой их ди-гитонином, было показано в работе Коукол и др., (Koukol et al., 1959), а затем в работах Веселза (Wessels, 1962, 1963). Позже Арнон с сотр. ('Arnon et al., 1968) сообщили о наличии нециклического и циклического фотофосфорилирования с различными кофакторами в тяжелых дигитонино-вых фрагментах хлоропластов. Легкие фрагменты обладали лишь способностью к циклическому фотофосфорилированию с ФМС, при этом менее активному, чем у тяжелых фрагментов.
