Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
2.. .3 г безводного сульфата натрия и встряхивают содержимое. Обезвоженный экстракт -пигментов используют для хроматографического анализа.
Приготовление адсорбционной колонки. Берут стеклянную трубку длиной 15 см, диаметром 1 см, нижний конец которой заужен. Перед набивкой колонки в него помещают ватную пробку, чтобы адсорбент не высыпался. Трубку постепенно заполняют тонко размолотым и хорошо просеянным диоксидом кальция. Уплотняют адсорбелт стеклянной палочкой с расширенным концом, диаметр которого должен соответствовать диаметру трубки, или постукивая колонкой о твердую поверхность.
Заполняют колонку до тех пор, пока уровень диок-
Рис. 16. Установка для разделения пигментов:
1 — колба для отсасывания; 2 — пробка; S — сюкляшкш трубка; 4 — патрубок для вакуума
сида кальция в трубке не будет па 2.. .3 см ниже верхнего ее края.
Получение хроматограммы. Готовую к анализу колонку при помощи резиновой пробки вставляют в колбу для отсасывания (рис. 16). Затем в трубку наливают чистый бензин и слегка отсасывают насосом.
Когда адсорбент будет смочен растворителем, переносят в ко- > лонку обезвоженный экстракт пигментов и дают раствору проникнуть в верхние слои адсорбента, а потом включают насос. После того как в нижней части трубки неокрашенным остается лишь небольшой слой диоксида кальция, отсасывание прекращают.
Таким образом получают первичную хроматограмму. Однако в ней еще не происходит полного разделения веществ смеси, поскольку зоны отдельных пигментов заходят одна в другую. Для полного разделения пигментов колонку промывают смесыо бензина и бензола в соотношении 10:'1. Под влиянием передвигающихся растворителей, конкурирующих с адсорбентом за связанные вещества, происходит четкое обособление окрашенных зон.
В конечном итоге пигменты располагаются следующим образом. Самая верхняя желто-зеленая зона — хлорофилл- Ь, ниже сине-зеленая зона — хлорофилл а и, наконец, в самом низу ярко-желтая зона — ксантофилл. Каротин вместе с растворителями полностью отсасывается в колбу.
Зарисовывают полученную хроматограмму, в выводах объясняют наблюдаемое разделение пигментов. Разделенные таким образом пигменты могут быть отделены затем вместе с адсорбентом с колонки и элюированы органическими растворителями.
Материалы и оборудование. Бензин, бензол, ацетон, сульфат натрия (свежепрокалеппый), поваренная соль, кварцевый пссок, листья растении, диоксид кальция.
Стеклянные трубки для разделения пигментов листа, колбы для отсасывания, насосы, кипнческие колбы, воронки обычные и делительные, фарфоровые стуикп с нестикамн, стеклянные фильтры № 2, пипетки на 25 мл, мерные цилиндры па 25 мл, мензурки па 10 мл.
Работа 41. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПИГМЕНТОВ В ЛИСТЬЯХ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Вводные пояснения. Метод основан на распределении пигментов между целлюлозой хроматографической бумаги и подвнжиой фазой — растворителями. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движутся растворители, молекулы пигментов, нанесенные на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения. Чем выше растворимость пигмента в подвижной фазе, тем дальше он продвигается по бумаге вместе с растворителем, и наоборот.
Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу пигментом в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным пигментом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. В стандартных условиях эта величина для данного пигмента постоянна и соответствует его коэффициенту распределения.
Хроматографирование на бумаге выполняют восходящим и нисходящим способами. При восходящей хроматографии бумажную полосу подвешивают вертикально; при этом нижний ее конец, на который нанесена смесь пигментов, погружают в растворитель. По мере движения растворителя под действием капиллярных сил вертикально вверх происходит разделение растворенных веществ.
При нисходящей хроматографии верхний конец бумажной полосы со смесыо пигментов, нанесенных недалеко от кромки бумаги, закрепляют в лотке, который размещают в верхней части камеры. Нижний конец бумаги располагают так, чтобы он не касался налитого на дно камеры растворителя. В результате действия ка-
пиллярных сил и силы тяжести растворитель начинает передвигаться вниз по бумажной полосе, в результате чего смесь разделяется. Нисходящую хроматографию как более простую применяют чаще.
Хроматографирование выполняют в герметично закрытых сосудах, где поддерживают насыщенную парами растворителей атмосферу, что предотвращает их испарение с бумаги. Для эффективного разделения пигментов толщина бумаги должна быть равномерной, а сама бумага—обладать достаточной плотностью.
В зависимости от цели исследования применяют одномерные и двухмерные хроматограммы. В первом случае определяют либо хлорофиллы, либо каротиноиды. Если необходимо осуществить полное разделение смеси пигментов на отдельные компоненты, применяют двухмерную хроматограмму. В этом случае последовательно разгоняют пигменты на бумаге сначала в одном направлении, а затем в направлении, перпендикулярном первому.
