Практикум по физиологии растений - Третьяков Н.Н.
ISBN 5-10-001653-1
Скачать (прямая ссылка):
Содержание хлорофилла в листьях растений составляет в среднем около 0,3% сырой массы (0,1.. .0,7 %). При расчете на 1 дм2 листовой поверхности количество хлорофилла варьирует в пределах 0,7.. .0,8 мг. Кароти-ноидов в листьях примерно в три — восемь раз меньше, чем хлорофилла.
Материалы и оборудование. Листья растений, 85%-й раствор ацетона, кварцевый песок, СаСОа, стандартный раствор Гётри, вазелин.
Весы, ножницы, ступки с пестиками, мерные колбы на 25 мл, воронки со стеклянным фильтром № 2, воронки, стеклянные палочки, фотоэлектроколориметр ФЭК-56М, спектрофотометр СФ-26, насос.
Приготовление раствора Гётри. В мерную колбу па 100 мл наливают 28,5 мл 1%-го раствора CuS04-5H20, 50 мл 2%-го раствора К2СГ2О7 и 10 мл 2 н. раствора NH4OH; доливают дистиллированной водой до метки и тщательно взбалтывают. Окраска раствора Гётри соответствует окраске раствора, содержащего 85 мг/л хлорофилла.
Работа 40. РАЗДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ ЛИСТА
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО ЦВЕТУ
Вводные пояснения. При исследовании биологических соединений постоянно возникает необходимость их выделения и очистки. Наиболее удобный и тонкий метод разделения смеси — хроматографический. Принципы хроматографии разрабо'таны русским физиологом М, С. Цветом в начале нашего века. Со времени начала использования хроматографии как аналитического метода исследования появилось множество ее модификаций, что значительно расширило область применения метода.
Все хроматографические системы состоят в основном из двух фаз: неподвижной (может быть твердой, жидкой или смесью твердой и жидкой) и подвижной (жид-
кой или газообразной). Обычно подвижная фаза перемещается по неподвижной или пропускается через нее. Хроматографическое разделение смеси веществ может идти при условии: адсорбционного равновесия между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами (адсорбционная хроматография); равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной жидкой фазами (хроматография на бумаге); равномерного распределения между неподвижной жидкой и подвижной газовой фазами (газожидкостная хроматография); ионообменного равновесия между ионообменной смолой (неподвижная фаза) и электролитом (ионообменная хроматография); равновесного связывания макромолекулы с малой молекулой, по отношению к которой она проявляет сродство (аффинная хроматография).
Распределение соединения между двумя несмеши-вающимися фазами определяется коэффициентом распределения (отношение концентрации вещества в каждой из двух фаз).
В основе классического адсорбционного метода разделения пигментов по М. С. Цвету лежат различия в степени адсорбции данных веществ адсорбентом и растворимости их в соответствующих растворителях. Адсорбент— твердое вещество, способное удерживать иа своей поверхности молекулы. • Если смесь пигментов листа и растворителей пропустить через колонку с пористым материалом, то отдельные пигменты будут располагаться на разных уровнях колонки, давая своеобразный спектр распределения, соответствующий их адсорбционному сродству. Чем слабее сродство пигмента к адсорбенту, тем ниже пигмент будет концентрироваться. Последующим промыванием чистыми растворителями получают хроматограмму с четким разделением адсорбированных веществ на зоны.
При адсорбционном разделении пигментов в качестве адсорбента используют диоксид кальция, оксиды магния и алюминия, сахарозу, крахмал, целлюлозу.
Порядок работы. Экстрагирование пигментов из растительного материала. Помещают в фарфоровую ступку около 3 г свежих листьев, измельчают их, добавляют немного СаС03 для нейтрализации клеточного сока и растирают с промытым кварцевым песком. К растертой массе приливают 15 мл смеси бензина и бензола в соотношении 9:1 и 10 мл ацетона.
Снова растирают., и перемешивают содержимое ступки до получения ярко-зеленого раствора.
По окончании экстрагирования смазывают снизу носик ступки вазелином и переносят вытяжку по палочке на стеклянный фильтр № 2, который предварительно вставляют в колбу для отсасывания, последнюю соединяют с насосом. Фильтруют при слабом отсасывании. Остатки растительного материала и ступку ополаскивают несколькими порциями ацетона, каждый раз сливая промывную жидкость на фильтр. Промывание ступки и осадка на фильтре считается законченным, когда промывная жидкость станет бесцветной.
Полученный после фильтрования экстракт пигментов переносят из приемника в делительную воронку и отмывают ацетон, который мешает адсорбционному анализу. Для этого в воронку осторожно вводят пипеткой 50 мл дистиллированной воды и жидкость слегка взбалтывают (при сильном взбалтывании возможно образование стойкой эмульсии).
После расслоения водно-ацетоновый слой сливают через кран воронки в приемник. Промывают пять-шесть раз. Если при добавлении воды на границе двух фаз появляются пенообразные хлопья хлорофилла, в раствор вводят кристаллическую поваренную соль. Под действием этой соли пигмент освобождается от воды и переходит в верхний бензин-бензоловый слой. Отмытый от ацетона раствор пигмента просушивают прокален1 ным сульфатом натрия. Для этого бензин-бензоловый экстракт переносят в сухую колбу, добавляют в нее
