Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
следующие реакции:
SH2 + NAD^-^S + NADH + Н +
NADHNMP+TCNQ'3JieKTP°^NAD+ + Н+ + 2е.
При более детальном описании кинетики ферментативного процесса мы
исходили из модели типа один субстрат-фермент-один продукт, согласно
которой субстрат S превращается в продукт Р с использованием кофактора
NAD + /NADH. Мы полагаем, что NAD+ присутствует в достаточном количестве
и, следовательно, концентрация свободного фермента Е много меньше
концентрации фермента, связанного с NAD+ (E NAD+). Положим также, что
связывание фермента с NAD+ происходит достаточно быстро и между Е и ENAD4
устанавливается равновесие с константой К0:
S + ENAD4 ^ S E NAD+ Ь P E NADH ^Е + NADH + Р + Н +
Амперометрические ферментные электроды
155
E + NAD+t±ENAD + К0
к'
На электроде: NAD -> NAD + + Н + + 2е.
Для этой схемы имеем
KTD = К0К1 К2 К3,
где K1D описывает суммарное равновесие между S + NAD+ и Р + NADH + Н +.
С помощью рассуждений, аналогичных приведенным выше, получаем следующее
выражение для /':
J
1 7
¦2
Н"
к'к л'" /2
Км , ./<??
LK*^m kpk'KTDsx [NAD+ ]
Lk'vk'KTDSoo[NAD+^
1 K2 1
,/c". /c_, k_
ex
^ (12.13)
(ell
Чтобы упростить это выражение, предположим, что внешняя концентрация
продукта р , равна нулю. Сопоставив уравнения (12.13) и (12.8), видим,
что они содержат одни и ге же члены /скат и Кы/ккат, характеризующие
кинетику ферментативной реакции, и k's, описывающий транспорт субстрата.
Это и неудивительно, поскольку обе схемы реакций идентичны вплоть до
момента высвобождения продукта Р. В схеме для электрода третьего
поколения реакция на электроде (с константой к') является одним из
переходных состояний, через которые фермент проходит в каждом цикле.
Поэтому члены, содержащие к' в уравнении (12.8), описывают как бы
дополнительное переходное состояние в насыщенной и ненасыщенной частях
выражения (12.13). В NADH-электроде фермент Е при освобождении
регенерирует путем быстрого связывания NAD'. Однако скорость этого
процесса может лимитироваться электрохимическим превращением NADH. Если в
уравнении (12.13) доминирующим является третий член, то концентрация
фермента сокращается и поток j не зависит от толщины слоя электролита L.
Учитывая, что концентрация продукта Р задается отношением j/k'P, получаем
простое выражение для потока:
j " к' [NADH]e4,
где [NADH]C1J равновесная концентрация NADH для данных концентраций
субстрата, продукта и NAD +. В этих условиях ферментная система быстро
приходит в равновесие, причем скорость этого процесса лимитируется
электрохимическим превращением NADH.
Что можно сказать о последнем, четвертом члене уравнения (12.13)? На
первый взгляд он представляется довольно странным. В него входят три
выражения, характеризующие кинетику как ферментативного, так и
электрохимического процессов, причем каждый компонент, по-видимому,
зависит от константы скорости обратного процесса. Фактически этот член
описывает весь цикл превращения фермента. В схеме для электрода третьего
поколения мы полагали, что электрохимическая стадия с константой скорости
к' необратима, так что каждый цикл превращения фермента отчетливо отделен
стадией с к'. В рассматриваемой же схеме фермент не подвергается
необратимому превращению, а на электроде разлагается NADH. Таким образом,
теперь нет необходимости в допущении, что каждый ферментный цикл
начинается и заканчивается E NAD + . Мы должны объединить все циклы в
непрерывную последовательность и затем найти среди них стадию с
наибольшим барьером. Учитывая, что, как и прежде, p= j/k'P и [NADH]
=j/k', мы можем интерпретировать четвертый член уравнения (12.13), как
показано на диаграмме свободной энергии (рис. 12.3). В этом
156
Глава 12
Рис. 12.3. Диаграмма свободной энергии, иллюстрирующая вклад четвертого
члена уравнения (12.8). В случае, показанном вверху, определяющим
является член с к_2 и функция электрода контролируется комбинацией
константы равновесия между ЕР и ES и константы скорости к2. Внизу показан
случай, когда определяющим является член с к_х, функция электрода
контролируется константой равновесия между ES и E-NAD+ и константой
скорости кх. Если же определяющим является отношение кх/к2, функция
электрода зависит от комбинации константы равновесия между ЕР и E-NAD4 и
константы скорости кх.
описании появляются константы скоростей обратных реакций, поскольку
изменение свободной энергии более удобно выражать как отношение суммарной
константы равновесия KTD и константы скорости обратной реакции, а не с
помощью более сложного выражения через константу скорости прямой реакции.
Появление на диаграмме рис. 12.3 константы скорости электрохимической
реакции связано с тем, что NADH выделяется перед скоростьопределяющим
процессом, а концентрация NADH зависит от кинетики электродного процесса.
Интересно, что, согласно уравнению
(12.13),у может меняться пропорционально [S], [S]1/2 и даже [S]1/3, в
зависимости с того, какой член уравнения является доминирующим.
Амперометрические ферментные электроды
