Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
Кроме того, сахарозу можно непосредственно определять с помощью инвертазы
(ЕС 3.2.1.26) в диапазоне 0,05-100 ммоль/л [24]. Этот пример показывает
одно из преимуществ ферментного термистора: он позволяет осуществлять
прямой контроль за последней реакцией без какой-либо другой сопряженной
реакции, что невозможно в других методах, например фотометрических. Можно
упомянуть еще два метода: галактозооксидазу (ЕС 1.1.3.9) используют для
определения галактозы, а аскорбатоксидазу (ЕС 1.10.3.3)-для определения
витамина С с диапазоном линейности 0,05-0,6 ммоль/л [24].
Определение триглицеридов [38] является наглядным примером ферментной
калориметрии с использованием только одного фермента там, где в
большинстве других
Рис. 29.3. Градуировочные кривые ферментного термистора с разделением
потока. В колонке термистора содержалась липопротеаза, иммобилизованная
на пористом стекле.
2
в
Триглицерид, лмоль/л
30-1145
466
Глава 29
методов потребовалось бы несколько ферментов. Липопротеинлипазу (ЕС
3.1.1.34) иммобилизовали на пористом стекле с размером пор 2000 А. Анализ
проводили в системе с разделением потока в 0,1 М буферном растворе Трис
(pH 8,0), содержащем 0,5% Тритон Х-100. Температурный отклик системы был
линеен для 0,05-10 ммоль/л трибутирина и 0,1-5 ммоль/л триолеина (рис.
29.3). Концентрацию триглицерида в сыворотке определяли после ее
двукратного разбавления буферным раствором Трис (до концентрации 3
ммоль/л). Результаты анализов хорошо коррелируют с данными, полученными
обычными спектрофотометрическими методами.
Еще одним примером липидного анализа может служить недавняя работа [39],
в которой для определения фосфолипидов использовали три последовательно
действующих фермента: фосфолипазу D, холиноксидазу и каталазу.
Растворимую в воде фосфолипазу D (36 ед. активности) добавляли
непосредственно в пробу объемом 0,05 мл, которую затем вводили в поток
буферного раствора (1 мл/мин, 0,1 М Трис-НС1, pH 8,0, 15 мМ СаС12, 0,5%
Тритон Х-100). Ферментная колонка была заполнена холиноксидазой и
каталазой, соиммобилизованными на пористом стекле. Область линейности
отклика охватывала концентрации от 0,03 до 0,19 мМ. Сыворотку можно было
анализировать непосредственно после 10-кратного разбавления, причем
получаемые результаты хорошо коррелировали с данными обычных методов.
Соиммобилизация всех трех ферментов приводила к довольно низкой
стабильности работы системы, тем не менее каждую колонку можно было
использовать в течение восьми недель или проводить не меньше 1600
анализов.
В настоящее время авторы изучают возможности использования ферментных
термисторов в биотехнологии, в частности для определения лактата в
бродильном бульоне. Этот метаболит также представляет клинический
интерес. Используя лактат-2-монооксигеназу (ЕС 1.13.12.4),
иммобилизованную на пористом стекле, можно определять концентрации
лактата как в стандартных водных растворах, так и в биологических средах
с высокой чувствительностью и воспроизводимостью в диапазоне концентраций
0,005-3 ммоль/л (диапазон линейности отклика 0,5-1 ммоль/л). Сравнение
калориметрического и электрохимического методов определения лактата
показало, что ферментный термистор обладает большей чувствительностью,
чем полярографический кислородный электрод в проточной ячейке,
соединенной с лак-татоксидазной колонкой того же типа, что и в ферментном
термисторе (В. Daniellson, I. Sato, В. Mattiasson, неопубликованные
данные).
В настоящее время стала вполне доступной оксидаза из Pedicoccus
pseudomonas (ЕС. 1.1.3.2). Использование ее в описанных выше системах с
рециклированием [40] позволяет достичь чрезвычайно высокой
чувствительности (10 нМ). Разумеется, этот фермент можно использовать в
ферментном термисторе, лучше в сочетании с каталазой, как в системе
глюкозооксидаза/каталаза.
Разработана также методика калориметрического определения щавелевой
кислоты в моче и сыворотке крови. Фирма Boehringer Manuheim производит
фермент окса-латоксидазу (ЕС. 1.2.3.4). С этим препаратом, а также
ферментом, выделенным авторами из ростков ячменя, получены весьма
обнадеживающие результаты. Концентрацию щавелевой кислоты в диапазоне
0,01-0,5 ммоль/л можно определять прямо в моче, разбавленной в 5-10 раз
[44]. Этот метод пригоден и для анализа пищевых продуктов.
Быстрое ферментативное определение этанола представляет интерес как для
клинической химии, так и для биотехнологии. В одной из недавних работ
[18] сравнивали результаты определения спирта ферментным электродом на
основе полярографического кислородного электрода и ферментным
термистором; в обоих случаях использовали один и тот же фермент -
алкогольоксидазу из Candida boidini (ЕС 1.1.3.13). Стабильность
алкогольоксидазы на пористом стекле в ферментном термисторе за-
Теория и практика калориметрических сенсоров
467
метно повышалась при соиммобилизации каталазы. Последняя непрерывно
удаляет образующийся пероксид водорода (в данном случае мешающий) и
