Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
уделять особое внимание. Изучение избирательности биосенсора на основе
ткани почки свиньи показало его пригодность для определения глутамина в
сложных биологических объектах. Специально изучалось влияние большого
числа соединений (мочевина, L-аланин, L-аргинин, L-гистидин, L-валин, L-
серин, L-глутаминат, L-аспарагин, L-аспартат, D-аланин, D-аспартат,
глицин и креатинин), которые могли бы создавать помехи работе сенсора, но
оказалось, что они не дают заметного сигнала. Как известно, в клетках
почки свиньи велика концентрация D-аминокислотной оксидазы [16], поэтому
проверяли также отклик сенсора на различные D-аминокислоты. В присутствии
кислорода и воды этот фермент катализирует окислительное деаминиро-вание
нескольких D-аминокислот. Однако в специфических условиях работы
глутаминовый биосенсор не обнаруживал чувствительности к проверяемым D-
аминокислотам. То, что побочные биокаталитические процессы не влияют на
сигнал биосенсора, по всей вероятности, обусловлено отсутствием
флавинадениндинуклеотида в буферной системе [23].
Для поддержания столь высокой селективности в систему необходимо ввести
какой-либо антимикробный агент, чтобы предотвратить загрязнение тканевого
слоя бактериями. В противном случае рост бактерий на тканевом материале
приводит к протеканию на поверхности датчика нежелательных
биокаталитических реакций, которые могут совершенно изменить ряд
избирательности сенсора. В качестве такого предохраняющего вещества в
глутаминовый сенсор добавляют 0,02% азида натрия.
О селективности тканевого глутаминового сенсора можно судить также по
результатам количественного анализа контрольных образцов спинномозговой
жидкости (СМЖ) [7]. После пропускания проб СМЖ через катионообменник для
удаления фонового аммиака, который может влиять на сигнал биосенсора,
концентрацию глутамина можно измерять с хорошей правильностью и
воспроизводимостью во всем клинически важном диапазоне. При этих
измерениях в рабочий буферный раствор следует вводить иодацетамид для
подавления мешающей реакции с участием глюкозы. По-видимому, в результате
гликолиза в почечных клетках из глюкозы образуется кислота, которая
влияет на потенциал pH-чувствительного аммиачного датчика. Иодацетамид
известен как ингибитор гликолиза и, как было найдено, эффективно
подавляет чувствительность глутаминового биосенсора к глюкозе.
Определение глутамина в СМЖ можно проводить в диапазоне концентраций 2,2-
10"5 -1,29- 1(П3 М со средним относительным стандартным отклонением 5,6%.
Такой сенсор может быть полезен, например, при изучении синдрома Рея, где
высокий уровень глутамина рассматривается как диагностический критерий.
Интересной особенностью тканевого глутаминового биосенсора является то,
что его срок службы существенно выше, чем у биосенсора с выделенным
ферментом. В случае чисто ферментной системы глутаминазу иммобилизуют на
поверхности аммиачного датчика с помощью тонкой ацетилцеллюлозной
мембраны. Найдено, что после сборки градуировочные кривые ферментного
сенсора достаточно быстро ухудшаются. На рис. 3.4 показано несколько
градуировочных кривых для сенсора с выделенной глутаминазой в качестве
биокаталитического компонента. Видно, что за считанные дни
38
Глава 3
Рис. 3.4. Градуировочные кривые отклика глутаминового ферментного
биосенсора. О -1-й день; О-2-й; Л-З-й; 0 - 4-й день.
сенсор становится непригодным из-за значительной потери активности
фермента. С другой стороны, тканевый глутаминовый сенсор оказалось
возможным использовать до 28 дней практически без изменений его
стационарного и динамического сигнала [39]. Столь большое увеличение
срока службы сенсора объясняется стабилизацией активности фермента в
тканевом носителе, поскольку в этом случае фермент находится в той
оптимальной среде, которую сама природа подобрала именно для его
функционирования. При определении срока службы в промежутках между
измерениями биосенсоры хранили просто в рабочем буферном растворе при
комнатной температуре. Таким образом, для хранения тканевого биосенсора
не требуется каких-либо особых условий и оборудования.
Глутаминовый биосенсор уникален в том смысле, что при его создании было
опробовано и изучено несколько типов биокаталитических материалов. В
поисках возможных биокатализаторов исследовали выделенную глутаминазу,
митохондрии клеток почки свиньи (см. ниже), кусочки ткани почки свиньи, а
также интактные бактериальные клетки штамма Sacrina flava [8]. Эти
материалы непосредственно сравнивали друг с другом, чтобы выявить
относительные достоинства каждого из них.
В табл. 3.2 и 3.3 обобщены наиболее важные характеристики глутаминовых
сенсоров на основе разных биокаталитических материалов. Все приведенные в
этих таблицах данные получены в оптимальных для каждого сенсора условиях.
Из табл. 3.2 видно, что относительные чувствительности, области
линейности градуировочных графиков, пределы обнаружения и времена отклика
у всех сенсоров сходны, хотя ферментный сенсор показывает плохую
