Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
можно уменьшить, используя обработанную ацетоном Е. coli. В анаэробных
условиях микробный сенсор нечувствителен к органическим веществам,
например глюкозе (7800 мг/л) и уксусной кислоте (9200 мг/л); влияние
неорганических ионов на его сигнал незначительно.
При анализе проб бродильных сред с известными концентрациями глутаминовой
кислоты при помощи микробного сенсора получены правильные значения (в
пределах
99-103%), хорошо согласующиеся с результатами, полученными на
автоанализаторах. Можно считать, что описываемый сенсор высокоизбирателен
и дает стабильные и воспроизводимые результаты.
Глутамататдекарбоксилаза катализирует реакцию декарбоксилирования
глутаминовой кислоты с образованием диоксида углерода и амина, однако
этот фермент очень дорог и неустойчив. Однако известно, что некоторые
микроорганизмы содержат глутаматдекарбоксилазу. Микробный сенсор,
чувствительный к глутаминовой кислоте, включает иммобилизованные
Escherichia coli (в качестве источника глутамаг-декарбоксилазы) в
сочетании с С02-электродом [5]. В предварительных экспериментах было
установлено, что Е. coli не выделяет углекислый газ в анаэробной среде в
отсутствие глутаминовой кислоты. Выделение бактериями в этих условиях
углекислого газа может быть лишь продуктом глутаматдекарбоксилазной
реакции. Для удаления растворенного кислорода из буферных растворов и
проб через проточную ячейку пропускали газообразный азот. При введении в
систему раствора пробы, содержащего глутаминовую кислоту, последняя
проникает через мембрану к иммобилизованным микроорганизмам и включается
в их метаболизм, что приводит к образованию углекислого газа.
Ферментативная реакция протекает при pH 4,4, что существенно ниже
значения рКа для углекислоты (6,34 при 25°С). В результате потенциал С02-
электрода постепенно возрастает. Измеряя максимальные значения
потенциала, анализы можно проводить через каждые 1-3 мин после
впрыскивания пробы с минимальной потерей чувствительности.
Для рассматриваемого сенсора график зависимости максимального потенциала
от логарифма концентрации глутаминовой кислоты линеен в диапазоне
концентраций
С сисоры на оспине микроорганизмов
29
100-800 мг/л. Стандартное отклонение для раствора, содержащего 400 мг/л
глутаминовой кислоты, составило 1,2 мг/л (20 измерений).
2.9. Цефалоспориновый сенсор
Антибиотики обычно определяют с помощью турбидиметрического или титри-
метрического микробиологического анализа, однако методики такого
определения довольно сложны и непригодны для экспрессных анализов.
Известно, что Citrobacter freundii вырабатывает фермент цефалоспориназу,
который катализирует реакцию цефалоспорина с выделением протона:
•CONH-
R,-CONH-
CH2R2
соон
+ н+
соон
Цефалоспориназа, однако, очень неустойчива и не подходит для изготовления
ферментного сенсора. В сенсоре, чувствительном к цефалоспорину, можно
использовать целые клетки Citrobacter freundii, которые иммобилизуют в
коллагеновой мембране, помещаемой затем в мембранный реактор.
На рис. 2.8 показана система для непрерывного определения цефалоспоринов.
Она включает реактор мембранного типа с прокладкой в середине. Измерения
pH, обусловливаемые ферментативной реакцией, измеряли комбинированным
стеклянным электродом и регистрировали с помощью самописца.
При введении в реактор растворов, содержащих различные количества
цефалоспоринов, разность потенциалов на электродах постепенно
увеличивалась, пока не достигала некоторого максимума. Минимальное время
отклика системы зависело от скорости потока и активности иммобилизованных
бактерий в коллагеновой мембране.
¦О
9
-О
Рис. 2.8. Сенсор проточного типа на основе иммобилизованных целых клеток
бактерий для определения цефалоспоринов. 1-натронная известь; 2-емкость с
буферным раствором; 3-перистальтический насос; 4-ввод пробы; 5-реактор с
иммобилизованными целыми клетками; 6-комбинированный стеклянный электрод;
7-измерительная камера; 8-усилитель; 9-самописец.
30
Глава 2
При скорости потока 2 мл/мин максимальная разность потенциалов
достигалась через 10 мин.
Получена линейная зависимость между максимальной разностью потенциалов и
логарифмом концентрации цефалоспорина. С помощью цефалоспоринового
раствора определяли 7-фенилацетиламидодезацетоксиспорановую кислоту (7-
фенилацетил-ADCA), цефалоридин, цефалотин и цефалоспорин С.
Стабильность микробного сенсора проверяли, анализируя раствор, содержащий
125 мкг/мл 7-фснилацетил-АОСА. Цефалоспорин определяли несколько раз в
день, однако наблюдаемая разность потенциалов не менялась в течение
недели.
Эту систему применяли также для определения цефалоспорина С в
культуральной среде Cephalosporium acremonium. Результаты измерений
сравнивали с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии. В случае микробного сенсора относительная погрешность
составила 8%, следовательно, сенсор вполне пригоден для непрерывного
определения цефалоспоринов в ферментационных средах.
