Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
1998) и др. На астроцитах человека был выявлен модулирующий эффект гена nef на TNF-alpha, что проявлялось в задержке апоптоза и, возможно, связано с нейродегенеративными заболеваниями, ассоциированными с HIV (Ro-bichaud, Poulin, 2000). В настоящее время ясно, что продукт гена nef, так же как и гена tat, взаимодействует в клетках с большим числом белков, участвующих в передаче клеточных сигналов и транспорте белковых продуктов (Benichou et al., 1994; Collette et al., 1996).
Таким образом, имеющиеся данные указывают на полифункциональ-ный характер действия генов nef и tat HIV-1 на клетки. Однако в полной мере молекулярные механизмы взаимодействия этих генов с метаболизмом клеток и их роль в развитии различных патологий у HIV-инфицированных пациентов остается неизвестной. Существует также множество вопросов связанных с ткане- и видоспецифическими эффектами продуктов этих двух регуляторных вирусных генов.
Для изучения функции и биологических эффектов отдельных регуляторных генов HIV/SIV на клетки широко использовались и используются два основных подхода: трансфекция этими генами различных культивируе-
151
мых in vitro клеток и создание трансгенных животных. Свои эксперименты по функциональной анатомии генома HIV мы также проводили с применением этих подходов.
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ РЕГУЛЯТОРНЫХ ГЕНОВ HIV НА МОДЕЛИ КУЛЬТУР КЛЕТОК
В большинстве работ для изучения функции отдельных регуляторных генов HIV на культивируемых клетках в качестве основного подхода использовали различные линии клеток человека, в которых преимущественно происходит размножение вируса (многочисленные линии Т-клеток, монону-клеарные клетки периферической крови, макрофаги и их производные, микроглия). Главным образом на этих типах клеток были показаны основные эффекты продуктов регуляторных генов на экспрессию клеточных генов, апоптоз, пролиферацию и трансформацию клеток. Вместе с тем известно, что вирус экспрессирует свои белки и при транфекции его в другие типы клеток (например, HeLa). Кроме того, продукты некоторых вирусных генов (в частности белок Tat) способны выходить из инфицированных HTV клеток и оказывать воздействие на другие типы клеток, дистанцированные от инфицированных вирусом.
Однако вопрос о клеточно-специфическом действии вирусных генов был исследован существенно меньше. Лишь в последнее время появились некоторые данные, свидетельствующие о том, что эффекты продуктов регуляторных генов HIV могут зависеть от типа клеток, на которые они действуют (Verhasselt et al., 1999). Также было обращено мало внимания на видоспецифическое действие генов HIV, хотя имеются отдельные наблюдения, свидетельствующие о наличии такой специфичности (Chang et al., 2000). В литературе существуют данные о том, что даже в клетках дрожжей отдельные регуляторные гены HIV могут проявлять свои эффекты. В частности, описаны перестройки цитоскелета дрожжевых клеток под действием гена nef (Plemenitas et al., 1999), влияние регуляторного гена vpr на митохондриальную дисфункцию дрожжей (Macreadie et al., 1997). Последнее, например, позволило описать один из возможных механизмов, который обеспечивает остановку роста HIV-инфицированных клеток на стадии G2/M, наблюдаемую под действием единичного гена vpr на клетки человека.
Нами была проведена серия работ по трансфекции разных типов клеток крысы рекомбинантными плазмидами, содержащими регуляторные гены ВИЧ tat и «^/(Шугурова и др., 1997, 2000; Shugurova et al., 2002). Была поставлена задача изучить как клеточно-специфические, так и возможные видоспецифические эффекты (по сравнению с аналогичными клетками человека) указанных регуляторных вирусных генов. Известно, что в клетках грызунов имеются многочисленные препятствия для размножения HIV (Beniasz, Cullen, 2000), однако это обстоятельство, на наш взгляд, должно было только способствовать изучению более тонких механизмов генерализированного взаимодействия продуктов вирусных генов с клеточным метаболизмом.
В работе были использованы три линии клеток крысы: линия феохро-моцитомы PC 12, псевдонормальные клетки линии Rat-2 и первичные фиб-робласты. Кроме того, эксперименты проводились на эмбриональных ство-
152
ловых клетках мыши (об этом подробнее см. в статье Гривенникова И.А. и др., наст, сборник).
На первом этапе все линии клеток котрансфецировали геном tat HIV-1, находящемся под контролем индуцируемого цинком металлотионеинового промотора мыши, и плазмидой, содержащей ген пео. Для анализа ростовых характеристик (пролиферации и способности образовывать фокусы) и морфологии трансфецированных клеток использовали получаемые в результате трансфекции поликлональные культуры клеток, резистентных к антибиотику G-418. Как клетки Rat-2, так и клетки PC 12, трансфецированные геном tat, характеризовались существенно более высокой пролиферативной активностью по сравнению с контрольными клетками. В обоих случаях этот эффект усиливался при добавлении в среду индуктора - ZnS04 (рис. 50). Эти результаты соответствуют данным, полученным ранее на хондроцитах человека и клетках PC 12, которые указывали на активирующее действие гена tat HIV-1 на пролиферацию этих клеток (Lotz et al., 1994; Zauli et al., 1995). В экспериментах, проведенных на клетках PC 12, было выявлено влияние белка Tat на передачу сигналов в этих клетках, в частности, за счет усиления фосфорилирования фактора pl25FAK и его ассоциации с фосфоинозитид-3-киназой (Milani et al., 1998). Возможно, этим влиянием отчасти и обусловлено наблюдаемое в наших и других экспериментах усиление пролиферации PC 12 клеток под действием гена tat. Следует отметить, что наряду с этим в литературе имеются данные об ингибирующем действии белка Tat на пролиферацию лимфоцитов (Patki, Lederman, 1996). В частности, в первичных нейронах человека белок Tat вызывал апоптоз через вовлечение в данный процесс окислительного стресса (New et al., 1998).
