Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
фффффф
6
Рис. 70. Электрояяо-микроскопитеское изображение каталитическойР]) части Н+—АТРазы Lactobacillus casei
Увеличение 27 ООО раз (а, в — е) или 1 530 ООО раз (б). Справа показаны разлитаые проекции модели, а, е — е — исходные микрофотографии; б — наложение изображений молекулы Н+—АТРазы при вращении на 60° (по: Бикетов и соавт. [258])
4.3. Н+—АТРаза внешней клеточной мембраны растений и грибов 197
На вывернутых субклеточных частицах L. casei было найдено, что гидролиз АТР тормозится ДЦКД.
Три различных метода, примененных ранее в опытах с митохондриями для диссоциации водорастворимой каталитической части (Fj) от комплекса F0Fj, привели во всех случаях к выделению белка с АТРазной активностью, устойчивой к действию низких концентраций ДЦКД, эффективных на субклеточных частицах.
Электронно-микроскопический анализ очищенного фактора Fx из L. casei показал [258], что шесть субъединиц образуют правильную двуслойную структуру с тремя субъединицами в каждом слое (рис. 70). Похожая структура была обнаружена при изучении митохондриального фактора Ft (см. ниже раздел 5.1.1.2).
Из мембран L. casei, лишенных фактора F1; был изолирован фактор F0 и встроен в протеолипосомы. После реконструкции с очищенным фактором Ft протеолипосомы демонстрировали взаимопревращение АТР — AjIH, чувствительное к ДЦКД и разобщителям [1031].
По молекулярной массе, субъединичному составу, трехмерной структуре и чувствительности к ингибиторам АТРаза L. casei явно отличается от АТРаз EjEj-rana. В частности, было показано, что ванадат и гидроксиламин, тормозящие все известные EjEj— АТРазы на стадии фосфорилированного фермента, никак не влияют на АТРазу из L. casei [140, 258].
Указание на то, что Н+—АТРаза строгих анаэробов напоминает FqFj, но имеет более простой набор субъединиц, было получено Кларком и соавт. [387], изучавшими Clostridium pasteurianum.
Проведенное Харольдом и соавт. исследование Н+—АТРазы факультативного анаэроба Streptococcus faecalis [683, 686] выявило субъединичный состав фактора Fb обычный для дышащих и фотосинтезирующих бактерий. Возможно, что S. faecalis представляет собой пример вторичного анаэроба, т. е. бактерии, первоначально жившей в аэробных условиях и затем перешедшей в бескислородную нишу (см. также [1005]).
4.3. Н+—АТРаза внешней клеточной мембраны растений и грибов
Во внешней клеточной мембране растений и грибов (плазмалемме) имеется фермент, откачивающий ионы Н+ из клетки за счет энергии АТР. Транспорт Н+носит электрогенный характер. Н+—АТРаза, о которой идет речь, относится к EjEj-Tnny. В процессе реакции возникает аспартилфосфатный интермедиат, чувствительный к ванадату и гидроксиламину. Ингибиторами служат также ди-этилстильбэстрол и ДЦКД.
198
4. Н+—АТРазы — вторичные ДцН-генераторы
Очистка Н+—АТРазы показала, что это одиночный полипептид с массой несколько больше 100 кДа. Его содержание во внешней мембране достигает 15% от общего количества белка (см. обзоры: 1108, 109, 620, 621, 992, 1352]). Первичная структура и упаковка в мембране остаются неизвестными.
Принято считать, что Н+—АТРазы из внешних мембран растений и грибов близки по своим свойствам, вплоть до общности антигенных детерминант. Однако есть указания и на определенные отличия. Так, N-этилмалеимид тормозит Н+—АТРазу плаз-малеммы дрожжей, но не растительных клеток [1374].
Механизм реакции Н+—АТРазы внешней мембраны, по-видимому, аналогичен таковому других EXE2—АТРаз (см. ниже раздел 7.1.3.2). Однако этот аспект еще ждет своего детального анализа.
Н+—АТРазы из мембран грибов [1556] и растений [1352] были реконструированы в протеолипосомы. В этой системе была показана обратимость гидролиза АТР, когда AY, искусственно созданная диффузией К+, использовалась для синтеза АТР 1992].
Уорнке и Слэймэн [1575], применив микроэлектроды, прямо измерили вольт-амперные характеристики Н+—АТРазы плазма-леммы клеток Neurospora crassa. Полученные данные сопоставили с результатами измерения АрН и свободной энергией гидролиза АТР, чтобы рассчитать отношение Н+/АТР. Оно оказалось близко к единице, повышаясь до двух в условиях протонного контроля. В той же лаборатории измерение отношения Н+/АТР другим методом (на мембранных пузырьках из плазмалеммы N. crassa) дало величину 1. Подобный подход, примененный к мембранным пузырькам из Е. coli, выявил отношение Н+/АТР, равное двум [1183].
Такешиге и соавт. [1485] показали посредством микроэлек-тродных измерений, что Н+—АТРаза ответственна почти за весь ток, генерируемый через плазмалемму клетки водоросли Nitel-lopsis obtusa (20 мА-м“2 при A’P = —220 мВ). В этом опыте тонопласт был удален перфузией. В перфузат добавляли АТР, чтобы снабдить АТРазу ее субстратом.
По-видимому, определенный биологический смысл имеет то обстоятельство, что Н+—АТРаза внешней мембраны характеризуется оптимумом pH между 6 и 7. При pH выше 7 активность фермента резко падает. Создается впечатление, что Н+—АТРаза, откачивая ионы Н+ из цитоплазмы, используется клеткой, чтобы предотвратить закисление внутриклеточного объема. Возможно, регуляция внутреннего pH есть одна из функций Н+—АТРазы плазмалеммы. В то же время очевидна и другая функция этого фермента: образуемая им А|1Н используется для концентрирования в клетке различных веществ, которые транспортируются туда вместе с протонами (см. ниже раздел 5.2).
