Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
На следующем этапе детергент медленно удалили диализом. Понижение концентрации детергента при диализе сопровождалось самосборкой одномембранных замкнутых пузырьков наподобие липосом Банхэма [218], но содержащих в своей мембране помимо фосфолипидов еще и белок (фактор F0). Последний этан — добавление водного раствора фактора Fx к Р0-протеолипосомам. Это имело следствием присоединение фактора F^ к протеолипосо-мам в силу его высокого сродства к фактору F0. Полученный комплекс F0Fb встроенный в мембрану протеолипосом, оказался способным расщеплять АТР. Скорость гидролиза ускорялась агентами, разряжающими АцН, как если бы АТРазная реакция генерировала AjiiH.
Тот же «холатный» метод был затем использован в лаборатории Ракера и независимо в нашей группе, чтобы реконструировать протеолипосомы с цитохромоксидазой [728, 774] или бакте-риородопсином [824]. Наконец, были получены протеолипосомы, содержащие как AflH-генератор (цитохромоксидазу или бактериородопсин), так и потребитель ДйН (факторы F0FX). В таких системах был продемонстрирован синтез АТР за счет энергии ды~ хания или света [488, 815, 1229].
Позднее многие другие генераторы и потребители А^Н были очищены и вставлены в протеолипосомы (см. обзоры: [428, 547, 1097, 1414]).
2.1. Измерение мембранного потенциала (A*F)
Рис. 8. Цитохромоксидазная протеолипосома
Метод замораживания и скалывания, электронная микроскопия (увеличение 61 ООО). Крупные молекулы цитохромоксидазы выступают из мембраны протеолипосомы (из работы Никольса [1110])
Электронная микрофотография цитохромоксидазных протео-лииосом (метод замораживания и скалывания) приведена на рис. 8.
2.1.2. Прямое измерение генерации A*F
протеолипосомами, сорбированными на коллодиевой пленке
В нашей лаборатории JI. А. Драчевым и соавт. [494J был разработан метод, позволяющий измерять непосредственно вольтметром генерацию AY ферментами, встроенными в протеолипосомы. Протеолипосомы сорбировали на одной из поверхностей коллодиевой пленки, пропитанной декановым раствором фосфолипидов с добавкой октадециламина. Последнее вещество, заряженное положительно при нейтральных и кислых значениях pH, облегчает сорбцию протеолипосом, несущих в тех же условиях отрицательный заряд, обусловленный фосфолипидами.
Как показали опыты, проведенные в нашей группе И. И. Севериной [119, 1357], сорбция протеолипосом происходит таким образом, что содержащийся внутри них раствор не перемешивается с наружным раствором. По-видимому, при сорбции мембрана на той стороне протеолипосомы, которая контактирует с пленкой, растворяется пропитывающим пленку деканом, а мембрана на другой ее стороне сохраняется, отделяя омывающий пленку раствор от раствора внутри протеолипосом.
Генерация AY на мембране сорбированных протеолипосом может быть зарегистрирована двумя электродами, которые помещены по обе стороны коллодиевой пленки и соединены с вольтметром (рис. 9).
Эквивалентная схема измерения приведена на рис. 10. Согласно схеме, AuH-генераторы, встроенные в сорбированную про-теолипосому, переносят заряды (скажем, Н+) через эту мембрану. Если поток Н+ направлен из раствора снаружи протеолипосомы в ее внутреннюю полость, эта последняя должна заряжаться положительно относительно обоих растворов, разделенных колло-
30
2* Специфические методы мембранной биоэнергетики
Рис. 9. Диаграмма электрических токов, генерируемых иротеолипосомами, сорбированными на коллодиевой пленке, пропитанной раствором фосфолипидов в декане
КП — коллодиевая пленка, Е — электрод, Г — Ди,Н-генератор, МП — мембрана протеолипосомы, V — вольтметр
Рис. 10. Эквивалентная электрическая схема системы «протеолипосомы — коллодиевая пленка»
КЛ — коллодиевая пленка; МП — мембрана протеолипосомы; е и rt — электродвижу* щая сила и внутреннее сопротивление ДиН-генератора, V — вольтметр; Е — электрод; Rx и Ci — сопротивление и емкость мембраны и протеолипосом; R2 — сопротивление поверхности раздела «коллодиевая пленка/вода» в местах, покрытых протеолипосомами-г2 — сопротивление внутренних областей коллодиевой пленки в тех же местах; С2 и с2 — соответствующие емкости; R3, г8, С3 и с3 — сопротивления и емкости тех мест пленки, где нет протеолипосом; Су — входная емкость вольтметра; Rm — сопротивление, шунтирующее коллодиевую пленку
диевой пленкой. Образованная таким образом A^F должна делиться пропорционально сопротивлениям: 1) участков пленки, покрытых протеолипосомами (R2), 2) свободных участков пленки (R3) и 3) мембраны сорбированных протеолипосом (Rjj.
В целом приведенная система может быть описана схемой компенсированного аттенюатора, поскольку константа времени покрытых протеолипосомами участков (R2-C2) равна таковой свободных участков (R3-C3), коль скоро и те и другие представляют собой части одной и той же коллодиевой пленки. Поэтому электрический ответ, возникающий, скажем, при включении AflH-
2.1. Измерение мембранного потенциала (АЧГ)
31
генератора, должен передаваться на электроды без искажения кинетики, хотя амплитуда ответа будет снижена 2.
Как показали опыты, сопротивление поверхности раздела липид/вода оказывается намного большим, чем сопротивление внутренней части коллодиевой пленки, пропитанной фосфолипидом в декане. Именно поэтому деление AY, образуемой AjJH-генератором, в системе «протеолипосомы — коллодиевая пленка», получается того же порядка, что в опытах, где протеолипосомы сорбировали на черной мембране. Кроме того, было найдено, что электрогенная активность А]1Н-генераторов может быть измерена в «двухфазной» системе, состоящей из 1) деканового раствора фосфолипидов (верхний слой), 2) воды (нижний слой), 3) электродов, погруженных в каждый из слоев, и 4) протеолипосом или природных мембранных пузырьков, сорбированных на поверхности раздела фаз (рис. И) [38, 39, 499].
