Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Фермент, связанный ;с частицами, может быть солюбилизирован различными путями. Во многих случаях солюбилизированные ферменты ведут себя в дальнейшем как все водорастворимые ферменты, и их фракционирование может быть проведено с помощью процедур, описанных в гл. 3—5. С другой стороны, иногда возникает необходимость солюбилизировать фермент, используя детергенты. В этом случае детергент, связанный с белком, замещает липидсодержащую мембрану. Если впоследствии детергент удаляют, белок может денатурировать или по крайней мере агрегировать и выпадать из раствора.
Большая часть подробно изученных мембраносвязанных ферментов относится к первой категории: их можно выделить с помощью физических, химических или энзиматических методов; полученный раствор фракционируют далее обычным способом. Много таких ферментов содержится в митохондриях, в том числе ферменты, ассоциированные с системой переноса электронов. Для их выделения используют следующие методы [19]:
а) Разрушение митохондрий для выделения белков матрикса с последующим выделением мембранных белков из митохондриальных фрагментов с помощью 1) ультразвука, особенно
Приготовление экстракта
53
при высоких значениях pH и повышенной температуре, 2) щелочи (pH 8—11) в присутствии или отсутствие агентов, образующих хелаты металлов (ЭДТА), 3) солюбилизации под действием детергентов, 4) органических растворителей (например, получение ацетонового порошка, экстракция w-бутанолом, этанолом и т.д.), 5) фосфолипазы А для расщепления липидов мембраны.
б) Классический способ, до сих пор находящий применение и заключающийся в экстракции липидов и получении ацетонового порошка [20]. Суспензию частиц обрабатывают несколькими объемами ацетона при очень низкой температуре (например, —20°С или ниже). Полученный таким образом обезвоженный порошок может храниться долгое время. Белки растворяют, диспергируя их в водном буферном растворе.
Типичным примером выделения мембраносвязанного фермента без использования детергентов служит получение АТР-азно-го комплекса из митохондрий сердца быка [21]. Прежде всего выделяют митохондрии с помощью метода, дающего наибольший выход. Затем для высвобождения белков матрикса митохондрии обрабатывают ультразвуком. Значение pH доводят до 9,2 в присутствии ЭДТА и снова проводят озвучивание, после чего большая часть мембранных белков митохондрий переходит в раствор. Активную водорастворимую ATP-азу выделяют из полученного раствора изоэлектрическим осаждением (разд. 3.2) и хроматографированием на ДЭАЭ-сефадексе (разд. 4.3).
Большинство мембраносвязанных белков можно экстрагировать из мембран в присутствии детергентов, в состав которых входят липофильные цепи, взаимодействующие с гидрофобными поверхностями белка и вытесняющие его из комплекса с нормальной мембраной. Из детергентов, используемых для этой цели, наиболее широко применяются дезоксихолат натрия и тритон. Тритон — это торговое название целой серии в большинстве своем неионных детергентов на основе полиэтиленгли-коля. Наиболее часто в различных целях используют тритон Х-100 (рис. 2.3), хотя детергенты других типов также находят определенное применение. Особенно полезным является недавно описанное цвитерионное производное холевой кисло-ты [22]. Детергенты способны вытеснять белок, прочно связанный с мембраной гидрофобными взаимодействиями, благодаря тому, что они, во-первых, растворяют мембрану и, во-
снз снз
СН3—С—СН2—С —о^сн^сн^о)^ н
сн3 сн3
Рис. 2.3. Структура тритона Х-100. п 9 10
54
Глава 2
Гидрофильный участок белка
Рис. 2.4. Действие детергента при солюбилизации мембранного белка. В зависимости от соотношения белка и детергента в растворе солюбилизированный белок может находиться в состоянии, показанном на рисунке, или образовывать с детергентом более сложную мицеллу.
вторых, замещают компоненты мембраны алифатическими или ароматическими цепями, которые составляют липофильную часть детергента (рис. 2.4).
Если белок солюбилизирован и установлено, что его целостность не нарушена, можно провести фракционирование, подобное описанному в следующих главах. В большинстве случаев это не представляет особой проблемы. Необходимо сохранить активность фермента; это зависит от выбора подходящего детергента. Неионные детергенты, такие, как тритон Х-100, очень мягки по своему действию, и большинство белков, как связанных с мембранами, так и свободных, выдерживают концентрации тритона Х-100 до 1—3% (вес/ об.) Напротив, некоторые анионные детергенты (например, доде-цилсульфат) обладают наряду с солюбилизирующими свойствами очень сильным денатурирующим действием. Они, по-видимому, не найдут широкого применения при выделении ферментов.
Липопротеины содержат ковалентно- или нековалентно- (но прочно) связанный липид, который в свою очередь погружен в мембрану и служит связующим звеном между белком и ча-
Приготовление экстракта
55
стицей. Экстракция в присутствии детергента может привести к удалению липида и замещению его детергентом. Это может быть причиной потери ферментативной активности, которая восстанавливается при добавлении природного липида — обычно фосфатида. С такими белками особенно трудно работать, так как они очень чувствительны к соотношению в растворе детергента и липида. Удаление детергента неизменно ведет к агрегации и чаще всего к денатурации.
