Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
К 10 г сухой клеточной массы, добавляют 0,1 мл 10%-ного> (по объему) раствора тритона Х-100, 10 мкл меркаптоэтанола. и 2,5 мл глицерина. Клетки диспергируют и энергично размешивают в течение 30 мин. Затем быстро добавляют 30 мл экстрагирующего буфера (например, 20мМ КРг, pH 7,0+1 мМ ЭДТА), содержащего 0,2 мг/мл лизоцима и 10 мкг/мл дезоксирибонуклеазы, и продолжают перемешивание еще 30 мин. К смеси добавляют 5 мг фенилметилсульфонилфторида, растворенного в 0,5 мл ацетона, и 0,1 мг пепстатина А, после чего суспензию центрифугируют (15000g в течение 20 мин).
Здесь приведено лишь несколько примеров процедур, используемых для получения экстрактов из различных источников. На практике чаще пользуются опубликованной методикой, но следует помнить, что применяемое сырье так же, как и оборудование, может значительно отличаться от описанных в методике, поэтому иногда возникает необходимость приспособить метод к определенным условиям.
Таким образом, в основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в соответствующем буфере с последующим центрифугированием смеси для удаления нерастворимых остатков.
В следующем разделе описано, как можно улучшить качество экстракта, служащего исходным материалом для очистки фермента.
2.3. ОПТИМИЗАЦИЯ И ОСВЕТЛЕНИЕ ЭКСТРАКТА
На этом этапе можно считать, что найден удовлетворительный метод разрушения клеток и получен экстракт. Чтобы иметь воспроизводимые результаты, важно получать по возможности
Приготовление экстракта
47
идентичные экстракты. Часто поведение белков при фракционировании зависит не только от их особенностей, но и от состава раствора, в который входят также и другие белки. Неудачи могут быть связаны с неоптимальными условиями гомогенизации (низким давлением в ячейке пресса, износом шариков в шаровой мельнице, затуплением лопастей гомогенизатора), что приводит к неполному разрушению клеток. В результате экстракт может быть более разбавленным и состав его будет другим, так как при неполном разрушении клеток не все компоненты переходят в раствор. Для оценки данного экстракта важно точно знать содержание фермента в одном грамме исходного материала. Пожалуй, лучше всего сначала получить экстракт из небольшого количества исходного материала, используя большой объем экстрагирующего буфера (скажем, 10 мл/г), и последовательно определять активность фермента через разные промежутки времени. С увеличением времени обработки активность фермента, вероятно, будет постепенно снижаться, так как сама обработка приводит к денатурации белков либо в результате нагревания, либо под действием сил сдвига в ходе измельчения материала. Часто бывает необходимо охлаждать систему в процессе .разрушения клеток. Для этого применяют охлажденный буфер и короткие периоды обработки материала чередуют с периодами охлаждения. Как упоминалось в предыдущем разделе, очень важно учитывать объем экстрагирующего буфера на грамм материала. При использовании больших количеств исходного материала приходится идти на компромисс между желанием добиться максимальной экстракции и стремлением получить минимальный объем экстракта.
До сих пор мы не говорили о природе экстрагирующего буфера, за исключением того, что для определенных целей он должен содержать вещества типа p-меркаптоэтанола. Для экстракции можно использовать и воду, но она экстрагирует не все белки. Было бы замечательно, если интересующий нас фермент полностью экстрагировался бы водой. Клетки содержат разные соли и много нерастворимого, несущего заряд материала — белки, фосфолипиды, нуклеиновые кислоты. Ионная сила в цитоплазме типичной клетки колеблется в пределах 0,15—0,2 М. В этих условиях цитоплазматические белки «растворимы» в том смысле, что они могут перемещаться в клетке. При гомогенизации клеток с 2—3 объемами воды ионная сила гомогената может снизиться до 0,05 и ниже. В этих условиях заряженные частицы в растворе могут действовать в качестве ионообменни-ков и адсорбировать белки, особенно основные.
В литературе имеется много данных о распределении ферментов между растворимой и нерастворимой фракциями. Если гомогенат готовится на разбавленном буфере, то чем больше
48
Глава 2
добавляется буфера, тем большая часть белка переходит в нерастворимую фракцию [15]. Не всегда учитываются ионообменные адсорбционные свойства (в отличие от физиологически важных специфических взаимодействий) клеточных компонентов. Для того чтобы быть уверенным, что все «растворимое» содержимое клетки перешло в экстракт, следует использовать буфер с ионной силой, близкой к физиологической, и, конечно» с соответствующим значением pH. Если при этом экстрагируется слишком много нежелательных компонентов, лучше пойти на компромисс. Обычно используют следующие буферы: 20— 50 мМ фосфат, pH 7—7,5, 0,1 М трис-НС1, pH 7,5 и 0,1 М КС1 с небольшим содержанием в нем буфера; для выделения органелл применяют изоосмотические буферные смеси, содержащие наряду с солями и буферными ионами сахарозу, маннит или сорбит. Буфер может содержать также ЭДТА (1—5 мМ), |3-меркаптоэтанол или цистеин (5—20 мМ) и специфические стабилизирующие агенты для определенных белков, например Zn2+ для цинкосодержащих белков или пиридоксальфосфат для ферментов, использующих его в качестве кофактора.
