Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
I этой цели или из гибридных
Ген устойчивости «^ен устойчивости ПлаЗМИД, сконструированных
специально как источники регуляторных элементов. Полученная конструкция
встраивается в подходящий вектор, например, pBR 322 (рис. 3.16), и ген экспрессируется в бактериальной клетке.
Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена Р-лактамазы (это ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst 1, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена. В результате трансляции был получен химерный полипептид Р-лактамазаинсулин, из которого после удаления аминокислотной последовательности р-лактамазы удалось получить биологически активный инсулин.
Промотор гена р-лактамазы нерегулируемый, а использование таких промоторов не всегда удобно. Дело в том, что большое количество белка может блокировать рост бактерий. Кроме того, интенсивная транскрипция рекомбинантной ДНК может помешать репликации плазмиды, и она будет утрачена. Поэтому удобнее использовать регулируемые сильные промоторы, включение которых, а значит, и синтез чужеродного белка можно осуществить, когда получена большая бактериальная масса. К таким промоторам относится термочувствительный промотор рL, который ответствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-репрессор, блокирующий действие этого промотора, активен при 31° С, но неактивен при 38° С. Таким образом, при инкубировании бактерий при 31° С чужеродный ген не экспрессируется. При повышении температуры pL-penpeccop инактивируется и наблюдается высокий уровень 184
Плазмида pBR322 Рис. 3.16. Структура плазмиды pBR 322
синтеза нужного белка. Его количество может достигать 10% суммарного белка, синтезируемого бактериальной клеткой.
Эффективной экспрессии генов в составе плазмиды можно также достичь и за счет некоторых других мощных регулируемых промоторов, например: 1) Тгр-промотора триптофанового оперона, который регулируется репрессором и может регулироваться 3-индолилуксусной кислотой или триптофановым голоданием; 2) Ьас-промотора лактозного оперона, который также регулируется репрессором и может индуцироваться субстратом (лактозой); 3) гибридного trp-lac(tac)-np0M0T0pa, который регулируется 1ас-репрессором.
Последовательность Шайна — Дальгарно и расстояние от нее до инициирующего кодона существенным образом влияет на эффективность трансляции. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-koh-цевых аминокислотных остатков происходят от прокариотического гена — источника регуляторных элементов и инициирующего кодона. Гибридные белки часто более стабильны, а химическая или ферментативная обработка позволяет выделить эукариотическую часть белка.
На эффективность продуктивности рекомбинантной ДНК в существенной степени влияет число копий этой ДНК в расчете на клетку. Суммарная активность экспрессируемого гена растет с ростом копийности плазмиды. Таким образом, используя многокопийные плазмиды, можно достичь сверхсинтеза нужных белковых продуктов. Обычно используемые плазмидные векторы (pBR 322 и др.) поддерживаются в клетке в количестве 20—50 копий. Сейчас исследователи имеют в своем распоряжении температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до одной-двух тысяч копий на клетку, не нарушая ее жизненно важных функций. Таким образом можно достичь сверхпродукции плазмидных генов бактериальными штаммами-сверхпродуцентами. Это и представляет собой краеугольный камень биотехнологии, поскольку может давать существенный экономический эффект.
Клонирование и экспрессия генов в бациллах и дрожжах. Успешное проведение генно-инженерных экспериментов на кишечной палочке — естественном обитателе кишечного тракта человека — стало стимулом для проведения аналогичных исследований с различными про- и эукариотическими организмами. Наибольших успехов в технологии рекомбинантных ДНК
удалось достигнуть с клетками хорошо изученных организмов Bacillus subtilis и Saccharomyces cerevisiae.
В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм, который растет строго при аэробных условиях. Бациллы не образуют токсинов и не патогенны ни для животных, ни для растений, тогда как клеточная стенка Е. coli содержит эндотоксин — ли-полисахарид, который довольно трудно отделить от веществ — продуктов генной инженерии. Кроме того, клеточная стенка бацилл имеет простую структуру, и бактерии могут сек-ретировать многие белки в культуральную жидкость. Так, 20 различных видов бацилл синтезируют в общей сложности более 40 ферментов с внеклеточной локализацией. Е. coli по сравнению с бациллами секретирует в среду относительно мало белков, что существенно затрудняет их выделение и очистку. В бациллах обнаружены плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов. Эти векторы способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев, в данном случае—в В. subtilis ив Е. coli. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид В. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов бацилл. Существует, однако, проблема экспрессии чужеродной ДНК. Дело в том, что гены Е. coli со своими регуляторными районами не функционируют в В. subtilis, и для преодоления этого барьера необходимо использовать собственные (гомологичные) регуляторные районы. Таким образом в Е. coli были проклонированы гены trp-onepoHa, преинсулина, антигенов гепатита В, ящура и их белковые продукты синтезировались в В. subtilis. Дрожжи Saccaharomyces cerevisiae принадлежат к эукариотическим организмам, и организация их генетического аппарата гораздо сложнее, чем у Е. coli и В. subtilis. Этот вид наиболее полно исследован с генетической точки зрения. В гаплоидных клетках содержится 17 хромосом. Однако размер генома невелик, всего в четыре раза больше, чем у Е. coli. В составе хромосом идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной два микрона (так называемое 2 мкм-кольцо). Эта дрожжевая плазмида содержит примерно 6300 пар оснований и имеет примерно 50—100 копий на клетку.
