Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Новая цепь ДНК синтезируется в направлении 3’ ->5\ Как уже отмечалось, для репликации необходимо локальное расплетение двойной спирали в той области, где ДНК в данный момент служит матрицей для синтеза дочерних нитей ДНК- Эта расплетенная часть молекулы называется репликативной вилкой. Ее можно наблюдать, если во время репликации на короткое время добавить радиоактивные («меченые») предшественники ДНК и экспонировать молекулы ДНК на рентгеновской пленке. Такое мечение ДНК называется импульсным. Таким 102
образом, репликация сопровождается перемещением репликативной вилки вдоль молекулы ДНК и синтезом новых цепей на каждой из старых. Но цепи ДНК антипараллельны, и логично предположить, что одна из дочерних цепей растет в направлении 5’—>3’, а другая — в противоположном, 3’ —>5’.
Поскольку молекула ДНК несимметрична, для репликации в двух направлениях нужно два различных фермента репликации— две ДНК-полимеразы. Одна из них наращивает цепь ДНК в направлении 5’-»3\ и тогда каждый очередной мономер (дезоксирибонуклеозидтрифосфат) обеспечивает сам себя энергией для присоединения к растущей цепи (носителем энергии является трифосфатная группа). Такой рост на полимерной цепи называется «ростом с хвоста». Другая полимераза наращивает цепь «с головы», т. е. присоединяет новый мономер к богатому энергией 5’-концу растущей цепи. Этот мономер, в свою очередь, использует свой трифосфат для присоединения следующего нуклеозидтрифосфата.
Однако у прокариот и у эукариот обнаружены, выделены и охарактеризованы (см. ниже) только 5’-»3’ ДНК-полимеразы. Возникает проблема синтеза другой цепи ДНК. Для ее решения существенную роль сыграли эксперименты по импульсному включению метки во время синтеза ДНК. Если метка дается на очень короткие промежутки времени, она включается в ДНК, синтезированную в последний момент. Мечеными оказываются те области новых цепей, которые расположены сразу за репликативной вилкой. Исследования размеров меченой ДНК показали, что при репликации бактериальной ДНК сначала на некоторое время образуются фрагменты длиной 1000—2000 нуклеотидов. Эти фрагменты назвали по имени их первооткрывателя — фрагменты Оказаки. При репликации эукариотической ДНК длина фрагментов Оказаки составляет 100—200 нуклеотидов. Было также показано, что синтез фрагментов идет в направлении от 5’ к З’-концу, и впоследствии они соединяются в длинные цепи ДНК. Так возникло представление, согласно которому синтез ДНК на обеих матрицах идет в направлении 5’—>3’ (от хвоста к голове). Но на одной из цепей новая ДНК синтезируется непрерывно, а на другой— фрагментами, стыкующимися в единую полимерную молекулу. Первая из цепей называется лидирующей, другая — отстающей (рис. 2.5). Таким образом, на отстающей нити синтез идет в направлении 5’-»3\ а сама цепь растет в направлении 3’—>5’. Это напоминает шитье «иголкой назад».
ДНК-полимераза— основной фермент репликации. Основные принципы и механизмы репликации сходны у прокариот и
Рис. 2.5. Структура репликативной вилки
у эукариот. Лучше всего изучена репликация у Е. coli. Основным ферментом репликации у Е. coli является ДНК-полимера-за III. Это сложный комплекс белковых молекул, состоящий из семи субъединиц с общей молекулярной массой около 700 кило-дальтон (кД). Некоторые из субъединиц сами по себе обладают полимеразной активностью, но репликацию в клетке (in vivo) осуществляет весь фермент, или холофермент. Перед связыванием с матрицей холофермент образует комплекс с АТФ, и последний гидролизуется в процессе связывания. Фермент связывается с ДНК практически необратимо, т. е. остается на матрице до окончания репликации. Скорость синтеза ДНК составляет около 1000 нуклеотидов в секунду (!).
В клетках эукариот обнаружены четыре ДНК-полимеразы. Аналогом ДНК-полимеразы III считают эукариотическую ДНК-полимеразу а (альфа). Во время S-фазы клеточного синтеза его количество существенно увеличивается, и он в основном ведет синтез ядерной ДНК- Молекулярная масса фермента — 500 кД. Скорость репликации примерно в 10 раз ниже, чем в прокариотических клетках (около 100 нуклеотидов в секунду).
Самокоррекция ДНК-полимеразы. Механизм репликации должен обеспечивать безошибочное копирование матрицы. Включение в новую цепь ДНК некомплементарных нуклеотидов влечет за собой возникновение мутаций, которые могут привести к генетическим изменениям, нарушающим структуру и функции генетического материала. Последствия таких мутаций сказываются негативно, а иногда пагубно для жизни клетки и всего организма.
Между тем в нормальной ДНК довольно часто (с частотой 10°—106) на короткое время возникают редкие таутомерные формы каждого из оснований. Такие измененные нуклеотиды при репликации могут спариваться с некомплементарными основаниями. Например, с цитозином может образовать пару аденин, а не гуанин. После возвращения нуклеотида в нормальное состояние водородные связи распадаются и нуклеотиды оказываются неспаренными.
Для избежания ошибочного спаривания ДНК-полимеразы обладают способностью к самокоррекции. Корректирующий механизм заключается в том, что перед присоединением каждого последующего нуклеотида к растущей цепи ДНК фермент «проверяет» правильность спаривания предыдущего нуклеотида. Если нуклеотиды спарены правильно (т. е. в соответствии с принципом комплементарности), полимераза присоединяет следующий нуклеотид, который впоследствии также будет проверен. Если же произошла ошибка спаривания, «неправильный» нуклеотид отщепляется от цепи ДНК- Затем проверяется нуклеотид, предшествующий вырезанному, и так далее. Вырезание нуклеотидов происходит из-за того, что ДНК-полимераза обладает кроме полимеразной еще и 3’-»5’-экзонуклеазной активностью. Когда полимераза, отщепив неспаренный нуклеотид или несколько нуклеотидов, дойдет до нормально спаренных нуклеотидов, восстанавливается ее полимеразная активность, и синтез ДНК продолжается до обнаружения очередной дефектной пары.
