Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
К началу 50-х годов были установлены основные принципы химического строения нуклеиновых кислот. Была выяснена структура их мономеров — нуклеозидов и нуклеотидов, и доказано, что и в ДНК, и в РНК нуклеотидные остатки связаны только 3’ — 5’-фосфодиэфирной связью.
Гены состоят из ДНК. До 40-х годов исследование нуклеиновых кислот считалось весьма скучным и вообще бесперспективным занятием. Так продолжалось до 1944 г., когда Эйвери, Мак-Леод и Мак-Карти установили, что дезоксирибонуклеиновая кислота является носителем генетической информации. Это выдающееся открытие, приведшее к установлению химической природы генов. Его история ведет свое начало с 1928 г., когда Фред Гриффит провел эксперименты с заражением мышей пневмококками. Пневмококки вызывают пневмонию у человека и других чувствительных к ним млекопитающих. Они обычно окружены слизистой блестящей оболочкой — полисахаридной
капсулой. Этот наружный слой имеет существенное значение для проявления патогенности бактерий. Мутанты, лишенные полисахаридной оболочки, не патогенны. Патогенные бактерии дикого типа обозначают буквой S (от англ. smooth — гладкий), так как они образуют гладкие колонии, а мутантные бактерии, не имеющие капсулы, — буквой R (от англ. rougth — шероховатый), так как они образуют шероховатые колонии.
Гриффит обнаружил, что непатогенный мутант можно трансформировать в патогенную S-форму следующим образом. Он инъецировал мышам смесь живых бактерий R-формы и убитых нагреванием пневмококков S. При этом были получены поразительные результаты. Оказалось, что указанная смесь вызывала гибель мышей, хотя ни живые пневмококки, ни убитые нагреванием пневмококки, инъецированные порознь, смерти мышей не вызывали. В крови погибших мышей содержались живые S пневмококки. Следовательно, убитые нагреванием пневмококки каким-то образом трансформировали живые R- и живые S-пневмококки. Это изменение стабильно наследовалось: трансформированные пневмококки давали патогенное потомство S-формы.
Впоследствии R+S-трансформацию удалось воспроизвести в бесклеточной системе (in vitro). Некоторые R-клетки в растущей культуре трансформировались в S-форму при добавлении бесклеточного экстракта убитых нагреванием пневмококков. Это открытие позволило установить химическую природу трансформирующего фактора.
Эйвери с сотр. в своих классических исследованиях показали, что трансформирующий фактор — это дезоксирибонуклеиновая кислота. Новое доказательство трансформирующей активности ДНК было получено несколько позже, когда удалось очистить фермент дезоксирибонуклеазу, разрушающую ДНК-Было показано, что добавление этого фермента необратимо инактивирует трансформирующий фактор.
Публикация выводов Эйвери с сотр. в 1944 г. была встречена с большим удивлением и недоверием, так как едва ли кто-либо ранее придавал ДНК информационную роль. Вездесущему присутствию ДНК в хромосомах большей частью приписывали чисто физиологическую или структурную роль. В то же время считали, что именно хромосомный белок придает генам информационную роль, поскольку еще в начале XX в. были выявлены различия в специфичности белков у различных организмов. Авторы понимали трудность обоснования генетической роли ДНК и в заключительной части своей работы высказали следующее утверждение: «Если результаты представленного 92
исследования о природе трансформирующего начала подтвердятся, то придется признать, что нуклеиновые кислоты обладают биологической специфичностью, химическая основа которой еще не установлена».
В 1952 г. Альфред Херши и Марта Чейз доказали генетическую роль ДНК в совершенно иной системе — при изучении вируса (бактериофага), заражающего бактерию ?. coli. Когда фаги добавляют к бактериальной культуре, они адсорбируются на наружной поверхности бактерии и вводят в нее определенное вещество, в результате чего примерно через 30 мин бактерия разрывается (лизирует), высвобождая большое число новых фаговых частиц—потомков, адсорбированных фагов.
Эксперимент был поставлен следующим образом. Бактерии инфицировали фагом Т2, у которого1 радиоактивным изотопом метили либо ДНК-компоненты (изотопом фосфора—ЙР), либо белковые компоненты (изотопом серы — AnS). Фаги смешивали •с бактериями и неадсорбированные частицы удаляли центрифугированием. Затем инфицированные бактерии энергично встряхивали и разделяли полученный препарат на две фракции путем центрифугирования. Одна фракция содержала пустые фаговые оболочки, отделившиеся от клеточной стенки бактерий, другая — сами бактерии. Анализ фракций показал, что S метка была связана с оболочками фага. Большая же часть метки ЦР оказалась внутри инфицированных бактерий. В потомстве фага после инфицирования было найдено примерно 30% исходной метки ,2Р. А от исходного белка в фаговом потомстве обнаружили лишь менее 1%. Этот эксперимент прямо показывает, что родительская фаговая ДНК проникает в бактерию и затем становится частью фагового потомства. Именно так должно происходить наследование генетического материала.
Эксперименты Херши и Чейз убедительно подтвердили факты, открытые восемью годами раньше Эйвери с сотр. на другой системе, и результаты работы были сразу восприняты как до; казательство генетической роли ДНК-
