Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
5. Доказательство интеграции у родившихся потоков и, если возможно, первое исследование экспрессии трансгена на уровне транскрипции (РНК) и трансляции (протеин).
6. Получение трансгенных потомков с использованием методов традиционного животноводства.
Приготовление раствора ДНК для микроинъекций. В растворе ДНК для микроинъекции должны отсутствовать механические примеси, которые могут вызвать закупоривание инъекционной пипетки или повреждение инъецируемых клеток. Растворы, соприкасающиеся с ДНК, предварительно стерилизуют, а посуду тщательно промывают. Конечную концентрацию ДНК устанавливают таким образом, чтобы в 1 пкл инъекционного раствора содержалось более 100 копий генной конструкции. Обычно используют раствор с концентрацией 1000 копий в 1 пкл. Для фрагментов ДНК длиной от 5 до 8 кб в 1 мл содержатся 100 копий при концентрации 1—2 мкг/мл. Связь между количеством инъецируемой ДНК и числом интегрировавшихся копий не обнаружена. Готовый для инъекции раствор ДНК хранят в замороженном состоянии.
Частота интеграции при получении трансгенных животных методом микроинъекции зависит от следующих факторов: очистки инъекционного раствора; формы ДНК (кольцевая, линейная); вида концов (тупые или неравные); концентрации ДНК; буферного раствора.
Таким образом, уже от приготовления инъекционного раствора зависит эффективность получения трансгенных животных.
Подготовка доноров и извлечение эмбрионов. При получении трансгенных животных исследователи стремятся к тому, чтобы все соматические и особенно генеративные клетки содержали генную конструкцию. Поэтому гены транспортируют на ранних стадиях развития животного: в большинстве случаев на стадии зиготы или 2-клеточных эмбрионов.
Для получения большого числа эмбрионов вызывают суперовуляцию у доноров, после чего их спаривают или осеменяют. Схемы гормональной обработки свиней и овец для вызывания суперовуляции и синхронизации охоты у доноров и реципиентов показаны в табл. 4.10, 4.11 и 4.12.
Таблица 4.10. Вызывание суперовуляции у свиней и синхронизация охоты у доноров и реципиентов
Дни Время суток Обработка
доноров реципиентов
---19 1 5 мл Регумейта 5 мл Регумейта
---5 О
о
---4 17-00 1500 и. е. СЖК 750 и е. СЖК
---1 17-00 750 и. е. ХГ 750 и. е. ХГ
0 17-00 1-е осеменение Выявление охоты
+ 1 7-00 2-е осеменение Выявление охоты
+ 2 8-00--- извлечение эмбрионов Пересадка эмбрионов
12-00
Таблица 4.11. Вызывание суперовуляции у овец и синхронизации охоты у доноров и реципиентов
Дни Обработка
0 Выявление в охоте
7 19-00 ФСГ --- 4 мг донорам
8 7-00 ФСГ --- 4 мг донорам
19-00 ФСГ --- 3 мг донорам
19-00 простагландин (эстуфалан ---1 мл) реципиентам
9 7-00 ФСГ --- Змг донорам
7-00 простагландин (эстуфалан --- 1 мл) донорам
19-00 ФСГ --- 2 мг донорам
10 17-00 ФСГ --- 2 мг донорам
11 7-00 Выявление охоты доноров и реципиентов и осеменение доно
ров
19-00 Осеменение доноров
12 14-00 Вымывание и пересадка эмбрионов
Таблица 4.12. Сравнение эффективности получения трансгенов у лабораторных и сельскохозяйственных животных (по Г. Брему, 1991)
Показатели Мышь Кролик Свинья Овца Круп
ный ро
гатый
скот
Число пригодных для 15 20 20 4 7
инъекции эмбрионов на
донора
Число доноров иа одного 2 2 2 1.5 1
реципиента
Беременность (%) 60 50 50 40 30
Родившиеся живот 10---20 10 5---8 15 10
ные/инъецированные эм
брионы, %
Степень интеграции 15 10 10---15 5---10 5---10
(трансгенные живот
ные/родившиеся живот
ные), %
