Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
образование продукта реакции (АДФ) происходит только за счет собственно
гидролитической реакции, а процесс активации АТФазы влияет на скорость за
счет изменения концентрации Е-S, а не за счет образования Р в результате
его отщепления из тройного комплекса S-E-S.
41
Решение системы уравнений, описывающих стационарное состояние (вывод
не приводится), выглядит следующим образом"
(21)
(21)
k | Д"
где Кат - --------------(константа Михаэлиса для АТФ в процессе
кл_А
окислительной активации фермента). Как обсуждалось в предыдущем разделе,
Кат численно равна /С(r) . Выражение (20) тогда может быть преобразовано:
Выражение (22) отличается от (19) добавочным членом в знаменателе,
характеризующим относительные скорости изомеризации фермент-субстратного
комплекса (ES) в неактивный (ES*) и активации под действием субстрата.
Выражение (21) описывает неконкурентный тип торможения (по сравнению с
(19)), что соответствует экспериментальным данным о неконкурентной по
отношению к АТФ активации АТФазы инкубацией в присутствии фос-
фоенолпирувата и пируваткиназы и о неконкурентном торможении второй фазы
реакции гидролиза АТФ по сравнению с первой (см. выше).
Модель, приведенная на рис. 1, не только качественно, но и
количественно хорошо описывает экспериментальные данные. Величина ks
легко измеряется как константа скорости торможения АТФазной реакции в
присутствии избытка АТФ и азида (см. схему (17)). Она равна ~0,7 мин-1.
Величина ks соответствует максимальной скорости активации АДФ-
блокированного фермента в присутствии насыщающих концентраций АТФ; она
равна ~2 мин-1. Отношение начальной скорости активированной АТФазы к
установившейся после перехода во вторую фазу гидролиза АТФ определяется в
соответствии с рассматриваемой моделью отношением выражений (19) и (22):
Полученная величина хорошо соответствует примерно 30%-ному торможению
второй фазы реакции по сравнению с первой, особенно если принять во
внимание, что величины k3 и k5 определены в независимых экспериментах.
Модель предсказывает, что степень торможения во второй фазе реакции не
зависит от концентрации АТФ, что при относительно больших концентрациях
субстрата хорошо согласуется с экспериментальными данными; при
концентрации АТФ<С/Ст двухфазности не наблюдается, по-
v - -
ft2-E0-S
(22)
1)35.
(23)
42
видимому, из-за очень длительного времени установления стационарного
состояния.
Основная цель многочисленных (в том числе и наших) исследований,
посвященных кинетике гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой, состоит в
выяснении механизма "обратной" реакции - синтеза АТФ. В связи с этим
возникает вопрос: какова роль кинетически значимых интермедиатов реакции
гидролиза АТФ (см. рис. 1) в реакции фосфорилирования?
При обсуждении этой проблемы возможны два принципиально различающихся
подхода.
Первый, пожалуй, наиболее популярный, основан на прямом приложении
принципа микрообратимости к реакциям, катализируемым любым ферментом. При
таком подходе фосфорилирова-ние АДФ должно описываться обратной
последовательностью реакций большого цикла схемы. Влияние
электрохимического потенциала ионов водорода на АТФазную активность
сводится при этом к обеспечению ее термодинамической обратимости.
Последнее в соответствии с принципом Холдейна [83] неизбежно должно
сказаться на кинетических параметрах фермента: Кт для субстратов и
значении максимальных скоростей. В более конкретной, хотя и чисто
гипотетической форме сказанное можно проиллюстрировать следующим образом.
Допустим, что реакция (3) большого цикла схемы на рис. 1 непосредственно
сопряжена с векторным переносом протона через Fo:
Это означает, что кажущаяся константа равновесия К для диссоциации
комплекса Е-АДФ обратно пропорционально зависит от
Эта зависимость может выражаться в уменьшении константы скорости ki
при увеличении Д[хН+. В условиях необратимой утилизации АДФ
пируваткиназной системой скорость гидролиза АТФ (у) будет определяться
стационарной концентрацией Е-АДФ и константой скорости ki.
Уменьшение величины ДцН+ добавлением разобщителей или возникновением
неспецифических утечек протонов через сопрягающую мембрану либо
невозможность векторного переноса протонов (растворимый Fi) приведет в
этом случае к увеличению скорости АТФазной реакции вследствие увеличения
k\. Так как в величину Кт для АДФ в процессе окислительного
фосфорилирования входит константа скорости распада комплекса Е-АДФ:
Е-АДФ^ЕЧ- АДФ + Н+ и К = -^-
(24)
ДцН+.
v = k\ [Е-АДФ].
(25)
(26)
43
где А - комбинация кинетических констант стадий 2 и 1 большого цикла,
снижение Д|д,Н+, приводящее к увеличению ki, должно привести к увеличению
Кт Для АДФ. Сказанное является простой иллюстрацией соотношения Холдейна,
