Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг - Пташне М.
ISBN 5-03-000854-3
Скачать (прямая ссылка):
В составе комплекса репрессора с оператором фага 434 два N-концевых домена связываются с одним операторным участком, который в данном случае имеет длину 14 пар оснований. Узнающая спираль каждого из доменов встраивается в большой желобок, а предшествующий участок а-спирали располагается поперек него. В целом структуры N-концевых доменов репрессора 434 и X на удивление сходны. Так, а-спиральные участки 2 и 3 репрессоров X и 434, образующие универсальный
119
ДНК-связывающий биспиральный элемент, в точности совпадают по своей пространственной конфигурации, а спиральные участки 1 (этот участок в репрессоре фага 434 короче) и 4 почти совпадают. ДНК находится в В-форме; некоторые отклонения наблюдаются лишь на концах операторного участка. Возможно, это связано с тем, что репрессор 434 слегка изгибает оператор.
Получение и свойства «гибридных спиралей»
[9, 38, 52, 60, 65, 66]
Узнающая спираль репрессора 434, которая располагается в большом желобке ДНК в комплексе репрессора с оператором,-важнейший, а возможно, и единственный элемент, определяющий специфичность связывания. Это следует из эксперимента, в котором структура репрессора 434 была модифицирована с целью изменения его специфичности. Мы называем этот эксперимент получением «гибридных» или «химерных» спиралей, хотя, возможно, правильнее было бы говорить о «конструировании» спиралей. Схема эксперимента изображена на рис. 4.25.
Идея его состояла в том, чтобы заменить аминокислотные остатки, расположенные на наружной стороне узнающей спирали репрессора 434, остатками, которые занимают аналогичные положения в другом репрессоре - фага Р22, инфицирующего Salmonella. При этом аминокислотные остатки на внутренней стороне спирали оставались прежними. Что считают наружной, а что внутренней сторонами узнающей спирали, разъяснено в гл. 2. Мы надеялись, что гибридная цепочка аминокислот образует а-спиральный участок, который займет нормальное положение относительно остальной части молекулы репрессора 434 и будет взаимодействовать с оператором фага Р22, но не фага 434. Обычные репрессоры фагов Р22 и 434 не обладают никаким сродством к «чужим» операторам ни in vitro, ни in vivo. Операторный участок Р22 имеет длину 22 пары оснований; последовательность участка 0R 1 фага Р22 представлена вместе с последовательностью оператора 434 на рис. 4.25.
В верхней части рис. 4.26 показано расположение аминокислот на поверхности узнающих спиралей репрессоров 434 и Р22, а в нижней - предполагаемое расположение аминокислот в искусственной узнающей спирали. Искусственный репрессор был сконструирован на основе репрессора 434 путем замены части его гена синтетическим фрагментом ДНК, кодирующим новую узнающую спираль. Модифицированный ген репрессора 434 присоединили к эффективному промотору. Клетки, содержащие такую конструкцию в составе плазмиды, продуцируют большое количество нужного белка.
120
ACAAGAAA6TTTGT ATTTAAGT6TTCTTT A AT
Т6ТТСТТТСАААСА ТАААТТСАСА АвАА АТТА
Гибридная спираль 3
Рис. 4.25. Получение «гибридных» спиралей. Аминокислоты, расположенные на наружной стороне узнающей спирали репрессора 434, заменены аминокислотами, занимающими аналогичное положение в репрессоре Р22.
Рис. 4.26. Узнающие а-спирали, использующиеся в опытах по созданию «гибридной» спирали. Три узнающие спирали изображены на рисунке так, что их ось оказывается перпендикулярной плоскости рисунка. Сравнение с рис. 2.3 показывает, что боковые группы аминокислот, лежащих на «наружной» поверхности, направлены в сторону ДНК.
121
Удивительный результат этого эксперимента состоял в том, что новый белок связывался с операторами Р22, но не с операторами фага 434 как in vivo, так и in vitro. Поэтому клетки, содержавшие этот белок, были устойчивы к заражению фагами Р22, но не 434, а очищенный белок связывался с тремя участками 0R фага Р22 с таким же сродством и в том же порядке, как и репрессор фага Р22 дикого типа. Этот эксперимент доказывает, что все структурные элементы специфичности, по которым различаются два репрессора, сосредоточены только на наружной стороне узнающих спиралей.
Роль «рук» Х-репрессора [27, 48, 64]
Структура комплекса операторов с репрессором, имеющим N-концевые «руки» подобно ?i-penpeccopy, не исследована методом рентгеноструктурного анализа, поэтому нам приходится судить о функции «рук» на основании более косвенных данных. Эксперименты по защите от метилирования под действием ДМС показывают, что «руки» образуют специфические контакты со звеньями G в большом желобке на задней стороне спирали (рис. 4.16). При связывании с 0R 1 репрессор или его N-концевой домен защищает от метилирования семь гуаниновых звеньев. Атомы N7 пяти из этих звеньев, которые подвергаются метилированию, расположены в большом желобке на передней стороне двойной спирали, а два атома N7 в положениях 8 и 9 «смотрят» в большой желобок на задней стороне.
Если удалить аминокислотные остатки 1-3 из интактного репрессора путем конструирования нового гена или из его N-концевого домена с помощью расщепления папаином, образуются репрессоры, которые защищают от метилирования только G, расположенные на передней стороне спирали. Удаление трех концевых звеньев приводит к уменьшению связывания интактного во всем остальном репрессора с оператором в 30 раз, а при удалении шести звеньев сродство уменьшается по крайней мере на три порядка.
