Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
зал, что после термального разрушения таких сетей и повторной сборки комплексов в них начинают преобладать двухвалентные молекулы стрептавидина, соединяющие соседние молекулы ДНК, получивших название ДНК-co держащих наночастиц (nanocircles). Как следствие, олигомерные конъюгаты стрептавидина с ДНК еще сохраняют значительную способность взаимодействовать с биотином, в том числе и в иммуно-ПЦР-тестах, направленных на конкурентное обнаружение низкомолекулярных гаптенов (рис. 22, б). В целом, фрагменты ДНК соединяют с антителами с помощью химических поперечных сшивок [293], химерных белков с двойной специфичностью [292], путем взаимодействия между стрептавидином и биотином [295], а также с использованием только что рассмотренных олигомерных самосо-бирающихся конъюгатов стрептавидин-ДНК [296].
6.3.12. Количественная ПЦР (ПЦР в реальном времени)
При исследовании нуклеиновых кислот методом ПЦР часто возникает задача определения числа копий матричной ДНК или РНК в пробе. Сравнение интенсивности свечения продуктов ПЦР, полученных обычными методами, после их разделения в агарозном геле в ряде случаев может дать какое-то представление о содержании матрицы, однако такой метод оценки не явля-
ется количественным. Между тем, имеется острая необходимость в точном определении различий в содержании матричной ДНК в 1,5 или 2 раза (например, для идентификации трисомии по хромосоме 21 при синдроме Дауна или гетерозиготных мутаций, соответственно). Не менее важной задачей является и определение числа копий мРНК в клетке для количественной оценки уровня экспрессии конкретных генов.
Теоретически количество ПЦР-продукта в пробе после завершения каждого цикла ПЦР должно удваиваться. Однако этого не происходит, поскольку в реальных условиях ни одна из стадий реакции не заканчивается со 100%-ным выходом. На эффективность прохождения отдельных циклов оказывают большое влияние различные ингибиторы ПЦР, причем наименее эффективными оказываются завершающие циклы. Поэтому предсказать количество продукта, которое должно образоваться по завершению ПЦР в каждом конкретном случае не представляется возможным. Этот клубок труднопреодолимых проблем частично удается распутать с помощью группы современных методов, получивших название ПЦР в реальном времени (real-time PCR). В основе таких методов лежит количественное определение содержания продукта ПЦР в реакционной смеси в каждом цикле реакции. Для этой цели разработано несколько подходов, в которых используются флуоресцентно меченные олигонуклеотиды.
Система TaqMan. В 1991 г. П. Холланд с соавт. предложили использовать 5'—>3'-экзонуклеазную активность Taq-полимеразы для контроля за эффективностью прохождения циклов ПЦР по освобождению в реакционную смесь флуоресцентной метки, ассоциированной с 5-концевым нуклеотидом зонда [297]. Именно этот подход лег в основу одного из наиболее широко распространенных современных методов количественной ПЦР в реальном времени. В разработке фирм Perkin-Elmer-Applied Biosystems данный метод получил название “TaqMan”. При реализации этого подхода обычно используют Taq- или Tth-полимеразы, однако, в принципе, те же функции может выполнять любая другая ДНК-полимераза, обладающая 5'—>3'-экзонуклеазной активностью, например, ДНК-полимераза Tfl [298].
На рис. 23, а представлена схема использования метода TaqMan для количественного определения мРНК. После синтеза кДНК стандартным методом с помощью обратной транскрипта-зы ее используют в качестве матрицы в ПЦР. В реакционную смесь, кроме двух обычных праймеров, добавляют олигонуклео-тидный зонд, меченный по 5-концу флуорофором, а также содержащий в своей центральной или 3-концевой части тушитель
J'niiiiiiiiiiiTmmmiirrmiiiiiiiiiiiiiiij
-3'
¦5'
I
Обратная
транскрипция
J'-
3'-
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiifiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiniiiiiiiiii
-3'
-5'
- Денатурация I Отжиг праймера
и зонда
5'н1111111ШГГ11111Г111111111111шш11111111111111111111
illllllllllilillllllllllll
3'
5'
5'-
3'
S0
inrmnnmmiZ.
JUUJ'
I
Гибридизация
Полимеризация
J'lMTTirrmmrmnnHTfinninnfniiiiiiiriiniiMjj
о о
Illllllllllilillllllllllll
3'
5'
5'
3'
Illllllllllilillllllllllll
I
....И"И"""».. Ч'
Вытеснение цепи зонда
J'
3'
iiniiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiimiiiiiiiiiiiiiiiiiinii
О
j'
I
Гидролиз ДНК Полимеризация
5'-
3'-
шмшшнмиш....................
г 3' 15'
J' — 7
3'
lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
-3'
¦5'
5'-
3'-
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
3'
5'
I
Денатурация
J'
ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТШТТТТТТТТТТТТТШТТТТТТТТТТТТТТТТТТШТТТТТШТТТГТТТПТТТТТТТТТТ
