Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
6.3.4. Гнездовая ПЦР
Этот метод часто выручает, когда другими способами не удается освободиться от неспецифических продуктов ПЦР и “шмира”. Принцип метода гнездовой ПЦР (nested PCR) заключается в последовательном применении двух пар праймеров, специфичных в отношении исследуемого локуса (рис. 19). Вначале проводят ПЦР с внешними праймерами. В результате по разным причинам синтезируется некий гетерогенный продукт, в котором нужный фрагмент может визуально не наблюдаться из-за его низкой концентрации. Небольшое количество образовавшегося продукта ПЦР без какой-либо очистки далее используют в качестве матрицы в новом раунде ПЦР, которую осуществляют с помощью новых (внутренних) праймеров, комплементарных внутренним последовательностям локуса, амплифицированного в первом раунде ПЦР. Поскольку только у специфического продукта ПЦР будут присутствовать места посадки для внутренних праймеров, амплификация всех остальных продуктов ПЦР, представляющих “шмир” и полосы непонятного происхождения, с внутренними праймерами происходить не будет. К одному из недостатков метода, который одновременно является и его достоинством, следует отнести его чрезвычайную чувствительность, что при неаккуратной работе может стать легким источником ложноположительных результатов из-за загрязнения специфическим продуктом ПЦР компонентов реакционной смеси.
6.3.5. ПЦР с “горячим стартом ”
Хотя оптимальной температурой для синтеза ДНК термостабильными ДНК-полимеразами является ~72°С, они активны и при комнатной температуре. В то же время при низкой температуре создаются идеальные условия для неспецифического взаи-
Отжиг внешних праймеров
3'
Праймер 2
Праймер 1
3'
5'
Первая амплификация
Первый
ПЦР-продукт
Отжиг внутренних праймеров
Праймер 4
Праймер 3
Вторая амплификация
Конечный продукт ПЦР
Рис. 19. Гнездовая ПЦР [273]
С помощью праймеров 1 и 2 синтезируют первый продукт ПЦР, который служит матрицей во втором раунде ПЦР с праймерами 3 и 4
модействия праймеров и матрицы в случае их неполной компле-ментарности в соответствующих участках. В такой ситуации 3’-концы праймеров, доступные ДНК-полимеразе при комнатной температуре и выше вплоть до температуры денатурации комплексов праймер-матрица, удлиняются, а образующиеся при этом полностью комплементарные матрице участки служат эффективными праймерами в следующих циклах ПЦР. В итоге образующиеся по данному механизму продукты ПЦР не имеют ничего общего с последовательностью нуклеотидов, которую было
необходимо амплифицировать. Для преодоления этого затруднения необходимо создать условия, при которых удлинение праймеров начиналось бы только после их отжига с соответствующими последовательностями матрицы, при понижении температуры после стадии денатурации в первом цикле ПЦР.
Имеется несколько подходов, получивших название ПЦР с “горячим стартом” (hot start PCR), которые позволяют достичь желаемого результата. В самых первых системах ДНК-полимеразу и остальную часть реакционной смеси разделяли с помощью легкоплавкого физического барьера (воска) [274]. При таком подходе все компоненты реакционной смеси, кроме ДНК-полимеразы и матрицы, вносят в нижнюю часть пробирки, на смесь наносят легкоплавкий полимер и пробирки прогревают с тем, чтобы он расплавился, и затем охлаждают до его застывания. Далее сверху наслаивают масло, а под масло вносят недостающие компоненты. Плавление барьера происходит в первом цикле ПЦР после прогревания пробирок до -55°С, что сопровождается объединением всех компонентов реакционной смеси, и ПЦР начинается.
В альтернативных подходах объектом воздействия является непосредственно ДНК-полимераза. В одном случае образуют комплекс моноклональных антител с ферментом, в котором антитела инактивируются при прогревании в первом цикле ПЦР [275], в другом случае фермент модифицируют по некоторым аминокислотным остаткам термолабильными химическими группами, что делает его неактивным при комнатной температуре. Активация Taq-ДНК-полимеразы происходит после ее прогрева в течение 2-4 мин при 95°С [276]. Недостатком этого метода является снижение удельной активности Taq-ДНК-полимеразы, а, следовательно, и эффективности ПЦР в целом. Олигонук-леотидные аптамеры, специфически взаимодействующие с Taq-ДНК-полимеразой, также могут быть использованы для горячего старта [277]. Однако, по своей природе этот метод не является универсальным, так как в ряде случаев невозможно исключить взаимодействие аптамеров с праймерами или матричной ДНК.
Наконец, в последнее время разработан вариант ПЦР с горячим стартом, в котором из реакции при низкой температуре выводятся праймеры, образующие характерную вторичную структуру, разрушающуюся при нагревании [278]. Для реализации этого подхода к 5-концам праймеров присоединяют одинаковые последовательности, которые отсутствуют в матричной ДНК. ПЦР . проводят в присутствии трех праймеров: двух, специфичных в отношении амплифицируемого участка ДНК, и одного, комплемен-
