Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
сона, прионовых заболеваний и спиноцеребральной атаксии. Приложения внутриклеточных антител к миру растений рассмотрены в обзоре [240].
Доменные антитела. В конце 1980-х гг. группой Г. Винтера (Великобритания) из клонотеки Ун-фрагментов мышиных антител, экспрессирующихся в клетках Е. coli, были выделены полипептиды, специфически взаимодействующие с лизоцимом [244]. Такие фрагменты антител (молекулярная масса 15 кДа) были вдвое короче обсуждавшихся выше одноцепочечных scFv-фраг-ментов, и они являются наименьшими фрагментами антител, которые еще сохраняют свою специфичность при взаимодействии с молекулами антигена (рис. 55,6). Поскольку эти фрагменты включают в себя вариабельные домены тяжелых цепей иммуноглобулинов, они получили название доменных антител (domain antibodies - dAb) [245]. Аналогичными свойствами обладают вариабельные домены легких цепей иммуноглобулинов. Каждая молекула dAb обладает тремя из шести природных CDR-участ-ков вариабельных частей антител, определяющих специфичность этих макромолекул. Природным прототипом таких молекул являются антитела верблюдов, которые представлены только тяжелыми цепями. Антигенсвязывающий участок полипептидных цепей этих антител представлен одним неспаренным вариабельным доменом, обозначаемым VHH.
Высокая специфичность и малый размер dAb делают их особенно удобными для получения путем отбора из комбинаторных клонотек последовательностей, а также для осуществления аффинного созревания и наработки в большом количестве с помощью генно-инженерных методов. Кроме того, небольшие молекулы легче доставляются к мишеням внутри организма при терапевтических воздействиях. В то же время короткие полипептиды значительно менее стабильны в биологических жидкостях по сравнению с полноразмерными антителами, что ограничивает их клиническое применение. Для преодоления этого затруднения проводятся работы по созданию конъюгатов dAb с полиэтиленгликолем, сывороточным альбумином, а также Fc-фрагментами или целыми константными частями молекул антител. По предварительным данным каждый из таких методов существенно улучшает свойства dAb как потенциальных лекарственных препаратов. Так же, как и в случае scFv-фрагментов антител, dAb удобно димеризовать для повышения авидности и создания миниантител двойной специфичности. Альтернативно, гетеродимеризацию можно проводить, используя дисульфид-ную связь между доменами СН1 и CL, которая приводит к обра-
зованию Fab-подобной молекулы, обладающей двойной специфичностью, обеспечиваемой одним антигенсвязывающим сайтом. Уникальные свойства dAb позволяют рассматривать их в качестве удобной основы для создания полифункциональных антител нового поколения.
Несомненно важнейшим свойством как исходных антител, так и их рекомбинантных производных является их специфичность, что должно проявляться в отсутствии перекрестных иммунологических реакций с макромолекулами, обладающими общими свойствами с антигенами-мишенями. С помощью обсуждавшихся методик получения антител, в конечном счете опирающихся на иммунизацию экспериментальных животных, очень трудно быстро и эффективно решить эту задачу. Как и во многих других случаях на помощь пришли методы генной и белковой инженерии, которые обеспечили значительный прогресс в данном направлении исследований.
Клонотеки фрагментов антител. Разнообразие природных антител возникает, прежде всего, в процессе рекомбинации шести CDR-областей генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов и соматического гипермутагенеза. Количество молекул иммуноглобулинов, различающихся по своей первичной структуре, которые теоретически могут возникнуть в отдельном организме, оценивается в 1012—1014. В реальной жизни это число ограничивается размером популяции В-лимфоцитов организма и принимается равным ~108. Данные значения определяют верхний предел репрезентативности клонотек, при конструировании которых могут быть использованы два фундаментально различающихся первичных источника последовательностей нуклеотидов: 1) природные V-гены, полученные из ДНК доноров, 2) синтетические V-гены, полученные in vitro.
Природные источники V-генов иммуноглобулинов. При использовании природных источников последовательностей V-re-нов имеется в виду, что сама иммунная система животных или человека создает требуемое разнообразие этих последовательностей. При таком подходе мРНК В-лимфоцитов доноров используют для получения кДНК с последующей амплификацией с помощью ПЦР соответствующих последовательностей. При этом как у человека, так и экспериментальных животных доноры могут быть двух типов: предварительно иммунизированные (инфицированные) [246, 247] и не имевшие контакта с конкретным антигеном [248]. Современные базы данных предоставляют полную информацию о всех последовательностях генов клеток зародышевой линии человека VH, VK, Vy, а также J- и D-сегментов
(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/vbase-homepage.html), что позволяет амплифицировать с помощью ПЦР любую из этих последовательностей и использовать ее для конструирования кло-нотек генов.
